devagerald

Just another WordPress.com site

laporan sfs fraksinasi inti sel dan mitokondria

pada April 15, 2012

Laporan Praktikum                             Hari tanggal    : Senin, 26 Maret 2012

Struktur Fungsi Subseluler                  Waktu             : Pukul 08.00 s.d 11.00 WIB

PJP                  : Ramdan Hidayat, M. Si

Asisten            : Dian Rahmawati

M. Iqbal AkMutaqqin

Annisa Rosiyana

 

 

 

 

FRAKSINASI SUBSELULER

(PREPARASI, ISOLASI FRAKSI INTI, DAN ISOLASI FRAKSI MITOKONDRIA)

 

 

 

 

 

Kelompok 7

Dwi Ayu Setianingrum                       G84100013

Ahmad Ajruddin M                            G84100018

 Lasma Eliezabeth                               G84100024

Deva Krisna Kadarani                      G84100036

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

DEPARTEMEN BIOKIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2012

 

Pendahuluan

Fraksinasi merupakan suatu proses pemisahan kuantitas tertentu dari campuran yang dapat dibagi dalam beberapa jumlah kecil (fraksi) komposisi perubahan berdasarkan kelandaian (Hendra 1989). Fraksinasi subseluler adalah suatu metode pemisahan sel dalam beberapa fraksi menjadi organel-organel seluler (Campbell 2002). Pemisahan ini berdasarkan bobot jenis dari tiap fraksi. Metode yang digunakan adalah sentrifugasi. Sentrifugasi merupakan suatu metode yang digunakan dalam pencapian sedimentasi dimana partikel-partikel yang ada dalam suatu bahan dipisahkan dari campurannya (Boyer 2000). Prinsip yang digunakan yaitu objek yang diputar secara horizontal pada jarak radial dari titik yang dikenakan gaya sentrifugal.

Berdasarkan prinsip yang biasa digunakan sentrifugasi terbagi menjadi dua macam yaitu yang pertama, berdasarkan massa, ukuran atau panjang partikel dan yang kedua, berdasarkan densitasnya. Sentrifugasi bergantung pada kekuatan sedimentasi atau pengendapan partikel dengan memanfaatkan massa, ukuran dan densitas partikel. Semakin cepat partikel mengendap maka semakin efektif  proses sentrifugasi. Kecepatan sedimentasi atau pengendapan ini ditentukan oleh beberapa hal yaitu berat molekul dan berat partikel. Semakin tinggi bobot molekulnya maka semakin tinggi pula kecepatanya. Berat partikel akan mempengaruhi gerakan partikel ketika disentrifugasi.(Yuwono, 2008)

Sentrifugasi pada umumnya ada dua macam yaitu sentrifugasi zonal dan keseimbangan gradien densitas. Sentrifugasi zonal yaitu sentrifugasi yang menggunakan massa partikel sebagai teknik untuk memisahkan molekul-molekul yang berbeda ukuran atau panjangnya dan setelah disentrifuasi partikel-partikel tersebut akan terpisah sesuai dengan ukurannya pada lapisan-lapisan atau zona-zona yang berbeda-beda. Sentrifugasi keseimbangan gradient densitas merupakan sentrifugasi yang biasanya menggunakan pelarut berupa sesium Klorida (CeCl) agar densitasnya bergradieb dari atas ke bawah dan setelah disentrifugasi partikel tersebut akan berada pada posisi yang mana densitas partikel seimbang sama dengan densitas pelarutnya. Prinsip sentriguasi ini dinamakan sentrifugasi keseimbangan gradient densitas karena antara partikel dan cairan(dalam hal ini sesium klorida) berada pada posisi keseimbangan densitas yaitu keadaan isopiknik. Sentrifugasi ini biasa digunakan untuk memisahkan molekul-molekul yang perbedaan densitasnya hingga 0,02 g/mL/ molekul-molekul tersebut seperti molekul protein, DNA, dan RNA yang densitasnya pada larutan sesium klorida ialah 1.3 g/mL , 1.6-1.7 g/mL, dan 1.75-1.8 g/mL.

 

Gambar. Sentrifugasi diferensial (Collen et al 1996)

 

 

Tujuan Percobaan

Praktikum ini bertujuan memahami prinsip fraksinasi subseluler, menangani hewan uji dan terampil mengisolasi organ dari hewan uji serta terampil melakukan fraksinasi subseluler untuk mengisolasi salah satu organel subseluler.

 

Alat dan Bahan

Alat yang digunakan dalam praktikum ini adalah sentrifus Beckman J2-21 dan tabung sentrifus. Alat-alat lainnya yang juga digunakan adalah labu erlenmeyer, botol pembius hewan uji, gunting, pinset, nampan, tabung vial, gelas ukur, pipet tetes, dan pipet volumetrik. Selain itu juga menggunakan neraca analitik, kain blacu, corong, dan homogenizer.

Bahan yang digunakan hati tikus dari galur Sprague Dawley. Larutan yang digunakan adalah larutan sukrosa 0.25 M-EDTA 1 mM, larutan sukrosa 0.34 M-EDTA 1 mM, dan larutan sukrosa 0.25 mM-CaCl2 3 mM dan eter.

 

Prosedur Percobaan

Praktikum kali ini fraksinasi subseluler melibatkan tiga tahapan, mulai dari preparasi, isolasi fraksi inti, dan isolasi fraksi mitokondria. Tahap preparasi telah dilakukan pada praktikum sebelumnya.

Sisa homogenat  yang ada dimasukkan ke dalam tabung sentrifus dan ditambahkan 0.34 M-EDTA 1 mM sebanyak 20 ml. Kemudian di sentrifugasi pada 700 g selama 10 menit. Supernatan dipindahkan untuk isolasi mitokondria dan pelet untuk isolasi fraksi inti.

Tahap isolasi fraksi inti, pelet disuspensikan dalam tabung dengan 10 ml sukrosa 0.25 mM-CaCl2 3 mM. Suspensi disaring dengan dua lapis kain blacu dan sisa partikel seluler dicuci dengan 10 ml sukrosa–CaCl2. Filtrat yang diperoleh disentrifus pada 1500 g selama 10 menit. Supernata yang didapat dibuang dan pelet disuspensikan kembali dengan 10 ml sukrosa-CaCl2. Suspensi yang didapat dibagi ke dalam empat buah vial dan disimpan dengan label fraksi inti.

Tahap isolasi fraksi mitokondria menggunakan supernatan yang didapat pada tahap preparasi. Supernatan yang membeku didiamkan hingga mencair kembali. Setelah supernatan cair, disentrifugasi pada 5000 g selama 15 menit. Kemudian, didapat supernatan dan pelet. Supernatan dibuang dan pelet dipindahkan ke tabung sentrifus lain dengan ditambahkan 10 ml larutan sukrosa 0.34 M-EDTA 1 mM. Pelet dihomogenasi dengan alat penggerus, setealh halus ditambahkan lagi larutan sukrosa yang sama sebanyak 20 ml. Pelet kembali disentrifugasi pada 24000 g selama 10 menit. Supernatan yang didapat dibuang dan pelet disentrifus kembali seperti langkah diatas. Pelet yang didapat disuspensikan kembali dalam 10 ml larutan sukrosa-EDTA dan disimpan dalam tabung vial dengan label fraksi mitokondria.

Hasil dan Pengolahan Data

Tabel 1 Data hasil isolasi fraksi inti tabel 2 fraksi mitokondria

Meja

 ke-

Bobot tabung kosong (gram)

Bobot tabung + isi

(gram)

Bobot fraksi inti

(gram)

1

6.3100

7.9700

1.6600

2

6.3100

18.0000

11.6900

3

7.6400

8.2900

0.6500

4

15.6900

37.4600

19.5600

5

16.5900

32.9600

20.8700

6

16.8351

36.2800

19.4449

7

16.8351

43.6000

26.7649

Contoh perhitungan :

Untuk meja ke-7

Bobot inti = ( Bobot tabung+ isi ) – (Bobot tabung kosong)

= 43.6000 gram – 16.8351 gram

=  26.7649 gram

Tabel 2. Data hasil isolasi fraksi mitokondria

Meja

 ke-

Bobot tabung kosong (gram)

Bobot tabung + isi

(gram)

Bobot mitokondria

(gram)

1

16.2600

19.0700

2.8100

2

15.7334

16.4100

0.6766

3

16.3500

19.0700

2.7200

4

15.6900

17.5400

1.8500

5

16.5900

32.9600

16.3700

6

15.4300

16.8900

1.4600

7

16.8351

16.8700

0.0349

Contoh perhitungan :

Untuk meja ke-7

Bobot mitokondria = ( Bobot tabung+ isi ) – (Bobot tabung kosong)

= 16.8700gram – 16.8351 gram

= 0.0349 gram

Pembahasan

Percobaan kali ini mengenai fraksinasi subseluler. Ada tiga tahapan dalam percobaan ini, mulai dari preparasi, isolasi fraksi inti, dan isolasi fraksi mitokondria. Prinsip dari percobaan ini adalah partikel yang tersuspensi akan mengendap ke dasar karena pengaruh gravitasi, juga didasarkan atas massa, ukuran, panjang partikel, dan densitas partikel (Rickwood 1984). Fraksionasi sel ini dapat digunakan untuk mempersiapkan komponen-komponen spesifik sel dalam jumlah besar untuk mengkaji komposisi dan fungsinya. ( Campbell 2000) Komponen spesifik yang ada pada percobaan ini ialah inti sel dan mitokondria. Kedua organel ini merupakan perpustakaan genetik yang dimiliki oleh sel eukariot. Hal itu dikarenakan keduanya memiliki struktur DNA yang mengontrol sistem kerja pada sel tersebut.

DNA yang berada pada inti sel diorganisasikan dengan protein menjadi materi yang dinamakan kromatin. Ketika terjadi pembelahan sel benang-benang kromatin kusut dan menggulung menjadi tebal memadat sehingga membentuk suatu struktur yang disebut dengan kromosom. Kromosom merupakan pengendali genetik pada sel eukariot. Selain itu, inti sel merupakan pengontrol dari kerja sintesis protein dalam sitoplasma. Proses kontrol tersebut dilakukan oleh inti sel dengan cara mengirimkan mRNA(Massenger Ribonukleotida Acid) ke sitoplasma untuk menyampaikan pesan genetik melalui pori-pori inti sel. Inti sel mensintesis mRNA ini sesuai dengan perintah dari DNA. Ketika molekul mRNA berada di sitoplasma, mRNA akan melekat pada ribosom dan pesan genetik yang dikirimkan akan segera diterjemahkan(ditranslasi) menjadi struktur primer protein spesifik. (Campbell et al 2000) Mitokondria merupakan suatu penghasil energi terbesar yang sangat diperlukan oleh sel untuk melakukan metabolisme sel melalui proses respirasi. Selain itu, mitokondria juga memiliki suatu ciri khas yang tidak dimiliki oleh organel sel lainnya yaitu memiliki DNA ekstrakromosom. DNA pada mitokondria memungkinkan terjadinya reproduksi melalui duplikasi DNA (pembelahan mitokondria). Pembelahan sel berbeda dengan pembelahan mitokondria. DNA yang ada pada mitokondria dapat digunakan untuk mensintesis protein di dalam organelnya sendiri. Meskipun pada akhirnya protein hasil sintesis mitokondria dikodekan oleh gen penyandi milik inti sel dan selanjutnya akan disintesis di ribosom sitoplasma yang akan dimasukkan kembali ke mitokondria dengan suatu proses yang sangat rumit.       (Collen et al 1996)

Fraksionasi sel dilakukan dengan menggunakan alat sentrifuse yang prosesnya dinamakan sentrifugasi. Sentrifugasi ini dilakukan berdasarkan perbedaan densitas molekul sel. Percobaan ini menggunakan sentrifugasi untuk pemisahannya. Prinsip kerja sentrifus adalah memisahkan substansi berdasarkan berat jenis molekul dengan cara memberikan gaya sentrifugal sehingga substansi yang lebih berat (pelet) akan berada di dasar sedangkan substansi yang lebih ringan (supernatan) akan terletak di atas. Teknik ini dapat digunakan untuk mengisolasi dan mengkarakterisasi molekul biologi juga komponen subseluler (Underwood 1998). Isolasi fraksi mitokondria dilakukan sentrifugasi sebanyak dua kali. Penyebabnya organel mitokondria yang kecil membutuhkan perbedaan kecepatan yang besar dalam sentrifugasi. Hal ini dikarenakan semakin kecil ukuran suatu komponen sel maka akan semakin sulit untuk mendapatkan fraksinya dan semakin besar kecepatan yang digunakan untuk mengisolasi komponen tersebut (Hendra 1989).

Berdasarkan perbedaan densitas tersebut, mitokondria yang memiliki densitas yang lebih rendah dibandingkan dengan inti sel. Hal itu terbukti dengan praktikum yang telah dilakukan dengan mensentrifugasi homogenat pada kecepatan 700 g dalam waktu 10 menit menghasilkan pellet yang di dalamnya terdapat inti sel sedangkan sentrifugasi supernatannya pada kecepatan 5000 g dalam waktu 15 menit menghasilkan pellet yang di dalmnya terdapat mitokondria. Berdasarkan prinsip ketergantungan laju pengendapan terhadap densitas, semakin berat densitas partikel maka semakin banyak diperlukan kecepatan dan waktu untuk mensentrifugasinya.

Berdasarkan praktikum yang telah dilakukan, data yang diperoleh untuk proses isolasi fraksi inti sel pada ketujuh meja praktikan berturut-turut sebagai berikut 1.6600 g, 11.6900 g, 0.6500 g, 19.5600 g, 20.8700 g, 19.4449 g, dan  26.7649 g.  data pada praktikum isolasi fraksi mitokondria pada ketujuh meja praktikan berturut-turut sebagai berikut 2.8100 g, 0.6766 g, 2.7200 g, 1.8500 g, 16.3700 g, 1.4600 g, dan 0.0349 g. Data pada praktikum kali ini yang tidak bersesuaian dengan teori bahwa densitas mitokondria lebih kecil dibandingkan dengan densitas yang dimiliki oleh inti sel yaitu data pada meja kesatu. Data tersebut menunjukkan bahwa bobot inti sel lebih kecil dibandingkan dengan bobot mitokondria yaitu 1.6600 g (bobot inti sel)  <  2.8100 g (bobot mitokondria). Densitas adalah bobot per volume, jika bobotnya kecil maka densitasnya akan kecil pula. Data yang berbeda dengan teori tersebut merupakan data yang didapat dengan atas dasar kesalah saat melakukan praktikum. Kesalahan tersebut seperti homogenat yang disentrifugasi untuk mendapatkan inti sel hanya sedikit sekali dibandingkan dengan larutan 0.34 M-EDTA 1 mM yang ditambahkan.

 

Simpulan

Metode yang digunakan untuk fraksinasi subseluler adalah sentrifugasi. Prinsip sentrifugasi pada percobaan ini berdasarkan perbedaan massa, ukuran, panjang partikel, dan densitas partikel. Sentrifugasi digunakan untuk mengisolasi dan mengkarakterisasi molekul biologi juga komponen subseluler yaitu inti sel dan mitokondria berdasarkan perbedaan densitas yang dimiliknya. Inti sel dan mitokondria memiliki DNA yang sangat penting untuk metabolism sel terutama sintesis protein. Densitas inti sel lebih besar dibandingkan dengan densitas mitokondria ditunjukkan dari bobot inti sel yang lebih besar dibandingkan dengan bobot mitokondria. Semakin kecil ukuran suatu komponen sel maka akan semakin sulit untuk mendapatkan fraksinya dan semakin besar kecepatan yang digunakan untuk mengisolasi komponen tersebut.

 

Daftar Pustaka

Boyer Rodney. 2000. Modern Instrumental of Biochemistry Third Edition. SanFrancisco: Addision Wesley Longman.

Campbell et al. 2000. Biologi Jilid Kesatu Edisi Kelima. Jakarta: Erlangga.

Collen et al. 1996. Biokimia Kedokteran Dasar : Sebuah Pendekatan Klinis. Joko Suyono, penerjemah. USA : Basic Medical Biochemistry: a Clinical Approach.

Evenhius E. 1978. Methods of Folair Analysis. Amsterdam: Institute Voor deAmsterdam.

Hendra A. 1989. Teknik Pemisahan dalam Analisis Biologis. Bogor: IPB Press.

Rickwood D. 1984. Centrifugation : a practical approach. Washington DC : IRLPress.

Underwood AL. 1998. Analisis Kimia Kuantitatif. Sofian, penerjemah. Jakarta :Erlangga.

Yuwono, Tribowo. 2008. Biologi Molekuler. Jakarta : Erlangga.

 

 


Tinggalkan Balasan

Isikan data di bawah atau klik salah satu ikon untuk log in:

Logo WordPress.com

You are commenting using your WordPress.com account. Logout / Ubah )

Gambar Twitter

You are commenting using your Twitter account. Logout / Ubah )

Foto Facebook

You are commenting using your Facebook account. Logout / Ubah )

Foto Google+

You are commenting using your Google+ account. Logout / Ubah )

Connecting to %s

%d blogger menyukai ini: