devagerald

Just another WordPress.com site

BRADFORD

pada Maret 11, 2012

Laporan Praktikum                                          Hari/Tanggal   : Senin,5 maret 2012

Struktur dan Fungsi Subseluler                        Waktu            : 08.00-11.00 Wib

PJP                 : Ramdan Hidayat, M.Si

Asisten           :    1. Affan Iqbal

2. An nisa Rosiyana

 

PENENTUAN PROTEIN

(METODE BRADFORD)

Kelompok 7A

Dwi Ayu Setianingrum          G84100013

Ahmad Ajruddin Munshif           G84100018

Lasma Elizabeth                     G84100024

Deva Krisna Kadarani         G84100036

 

 

 

 

 

 

 

 

DEPARTEMEN BIOKIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2012

 

Pendahuluan

Protein merupakan suatu zat yang sangat diperlukan oleh tubuh kita sebagai sumber energi untuk dapat melakukan aktivitas sehari-hari. Sehingga kita perlu mengetahui dan menentukan kadar protein di dalam tubuh kita. Penentuan kadar protein tersebut dapat dilakukan dengan berbagai cara yang salah satuya adalah metode Bradford.  Metode lain dalam menentukan kadar protein yang biasa digunakan adalah metode Lowry.

Metode Bradford ialah suatu metode yang dapat digunakan untuk menganalisis kandungan protein di dalam suatu larutan dengan menggunakan zat warna Coomassie Blue G-250 sebagai pengikat protein. (Bradford 1976) Zat warna tersebut akan mengikat protein dan mengubah warna pada larutan yang mengandung protein tersebut dari warna kemerahan menjadi warna kebiruan. Ikatan yang terjadi antara zat warna Coomassie Blue G-250 dan protein dapat terjadi dikarenakan adanya gaya van der walls antara keduanya. Gaya van der walls dapat terjadi karena adanya bagian protein yang bersifat hidrofobik mengikat bagian dari zat warna Coomassie Blue G-250( penyusun reagen Bradford) yang bersifat non polar sehingga mengakibatkan zat warna tersebut melepaskan elektronnya ke bagian hidrofobik protein. Selain itu, antara zat warna dan protein juga terdapat kekuatan ionik yang memperkuat  ikatan antara keduanya dan membuat zat warna tersebut menjadi stabil. Hal ini lah yang  digunakan pada metode Bradford untuk menentukan kadar protein di dalam suatu larutan. Kandungan protein yang berikatan dengan zat warna tersebut dapat diukur dengan menggunakan instrument spectronic 20 D untuk mengukur nilai absorbansnya pada panjang gelombang kisaran 465-595 nm. Selanjutnya, nilai absorbans tersebut dapat digunakan untuk membuat kurva standar yang menjadi dasar penentuan konsentrasi dan kadar protein di dalam larutan. (Bradford 1976)

Panjang gelombang yang digunakan untuk mengukur nilai absorbans larutan yang mengandung protein berkisar antara 470-650. Hal itu dikarenakan metode Bradford bergantung pada kerja zat warna Coomassie Blue G-250 yang memiliki empat formasi ion yang berbeda-beda dengan nilai pKa 1,15 ; 1,82 ; dan 12,4. Zat warna yang digunakan pada metode Bradford ini dapat dalam bentuk anion dan kation.Bentuk kation zat warna ini ialah dye commassie yang berwarna merah dan hijau dengan nilai absorbansi maksimum berada pada panjang gelombang kisaran 470 nm hingga 650 nm.Bentuk anion zat warna ini ialah commasie yang berwarna biru dengan nilai absorbansi maksimum berada pada panjang gelombang maksimum 595 nm. Penentuan kadar protein pada suatu larutan dilakukan dengan menentukan jumlah zat warna dalam bentuk anion (commasie blue G-250) yang diukur dengan panjang gelombang 595 nm.(Bradford 1976)

Tingkat ketelitian metode Bradford dlam menentukan kadar protein cukup tinggi karena koefisien penghentian dari kompleks albumin larutan standar BSA adalah konstan selama rentang konsentrasi flip-10. Nilai presisi dan akurasi data dari metode Bradford cukup tinggi dalam hal penentuan kadar protein ataupun sampel lain. Metode Bradford sangat sederhana, cepat dan teliti serta dapat dilakukan pengujian ulang untuk sampel lain yang berada di luar jangkauan. Oleh karena itu metode Bradford sangat dianjurkan untuk mendeteksi suatu molekul selular seperti protein. Metode ini menentukan kadar protein bukan dari ikatan peptidanya namun metode ini mendeteksi suatu asam amino spesifik yang berada di dalam protein tersebut dan berikatan dengan zat warnanya.( Stoscheck 1990)

Tujuan Percobaan

Percobaan ini bertujuan untuk menentukan kadar protein suatu sampel dengan metode Bradford  menggunakan instrumen spektrofotometer 20 D dan  kurva standar absorbansi.

Alat dan Bahan

Alat-alat yang digunakan dalam percobaan ini adalah spektronik 20, kuvet, pipet volumetrik, bulb, gelas piala, tabung reaksi, dan gelas ukur.Bahan – bahan yang digunakan adalah akuades, larutan Bovine Serum Albumin (BSA) 0.1 mg/mL, larutan NaCl, dan reagen Bradford.

Prosedur Percobaan

Sebelum praktikum dimulai, praktikan harus menginventarisasi alat terlebih dahulu. Enam tabung reaksi dibersihkan dan dikeringkan dan kemudian diberi label masing-masing tabung ke-1, ke-2, ke-3, ke-4, ke-5, dan ke-6. Tabung ke-1 diisi 100 µL larutan NaCl saja. Tabung ke-2 diisi campuranantara larutan BSA 10 µL dan larutan NaCl 90 µL. Tabung ke-3diisi campuran antara larutan BSA 20 µL dan larutan NaCl 80 µL. Tabung ke-4 diisi campuran antara larutan BSA 30 µL dan larutan NaCl 70 µL. Tabung ke-5 diisi campuran antara larutan BSA 50 µL dan larutan NaCl 50 µL. Tabung ke-6 diisi larutan BSA 100 µL saja. Sebanyak 5 mL reagen Bradford ditambahkan ke dalam masing-masing tabung reaksi. Kemudian semua tabung dikocok agar larutan menjadi homogen dan dibiarkan kurang lebih lima belas menit dengan penutup parafilm agar larutan tidak menguap. Tabung ke-1 digunakan sebagai blanko.Kemudian semua tabung reaksi tersebut diukur nilai absorbansnya dengan memasukkan larutan ke dalam kuvet dan diukur pada panjang gelombang 595 nm di spektrofotometer.Setelah itu dibuat kurva hubungan antara absorban dengan konsentrasi protein dalam tabung beserta persamaan garisnya.Kurva tersebut digunakan sebagai kurva standar.Larutan sampel protein dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan diukur nilai absorbansinya.Pengukuran absorbansi pada larutan sampel diulang sebanyak dua kali.Nilai absorbans yang diperoleh digunakan untuk menentukan konsentrasi sampel.Konsentrasi sampel ditentukan dengan memasukkan nilai absorban ke persamaan garis yang sudah diperoleh pada percobaan pertama.

Hasil Percobaan

Tabel.1 Kurva Standar BSA

Tabung [Konsentrasi] (mg/ml) Absorbansi
1 0.0 0.000
2 0.1 0.168
3 0.2 0.210
4 0.3 0.191
5 0.5 0.360
6 1.0 0.925

 

Contoh perhitungan:

M1.V1 = M2.V2

1 mg/mL 0.01 mL M2 0.1 mL

M20.1 mg/mL

 

 

 

Gambar 1. Kurva Standar BSA

Tabel 2. Pengamatan Sifat Fisik Larutan Koloid

Ulangan Absorbansi [Sampel] (mg/mL)
1 0.311 0.3528
2 0.353 0.4009

 

Contoh perhitungan:

Dari persamaan garis grafik di atas, diperoleh konsentrasi sampel sebagai berikut:

Y= a+bx

Y= 0.003+0.873x

0.311= 0.003+0.873x

X=  = 0.3528 mg/ml

Keterangan:

Y= absorbansi

X= Konsentrasi sampel

 

Pembahasan

Berdasarkan percobaan yang telah dilakukan metode Bradford dapat mendeteksi adanya kadar protein dengan menggunakan kurva standar hubungan antara absorbansi dan konsentrasi larutan sampel. Absorbansi maksimum ntuk larutan asam pewarna Coomassie Blue G-250 berada pada panjang gelombang kisaran 470 hingga 595 nm.Zat warna Coomassie Blue G-250 ini memiliki dua bentuk yaitu anion dan kation.Kation ialah zat warna merah Coomassiedab anion ialah zat warna biru Coomassie blue. Metode Bradford ini memiliki reagen khusus yaitu reagen Bradford. Reagen ini tersusun atas larutan 100 mg Coomassie Brilliant Blue G-250 dalam 50 ml etanol 95% dan 100 ml 85% (w/v) asam fosfat diencerkan hingga volume 1 L dengan aquades. Sebelum digunakan campuran penyusun reagen tersebut disaring oleh kertas saring whatman nomor satu dan disimpan dalam botol amber (gelap) pada suhu ruang agar tidak terbentuk endapan, reagen akan stabil setelah beberapa minggu penyimpanan dan bisa digunakan.(Bradford 1976)

Metode Bradford yang digunakan untuk menentukan kadar protein pada suatu larutan bergantung pada kurva standar yang dihasilkan dari absorbansi dan konsentrasi larutan yang mengandung protein tersebut. Prinsip dasar dari metode Bradford ini ialah pengikatan warnaCoomassie Blue G-250 (komponen penyusun reagen Bradford) oleh protein.Metode ini hanya digunakan untuk mendeteksi protein yang memiliki konsentrasi hingga 20 µL.

Keuntungan dari metode ini adalah pereaksi yang digunakan sangat sederhana serta mudah disiapkan.Selain itu kompleks warna biru pada larutan yang diberi reagen Bradford sangat cepat terbentuk dan bersifat stabil. Kestabilan warna biru coomassieini karena adanya inteaksi antara lapisan hidrofobik dari protein dengan bentuk anion dari zat warna Coomassie Brilliant Blue G-250 yang menstabilkan bentuk anion tersebut (adanya gaya van der walls). (Bradford 1976)Selain itu, uji Bradford juga sangat menguntungkan karena nilai akurasi dan presisi data yang didapatkan cukup tinggi serta untuk menjamin keakuratan data sampel yang berada di luar jangkauan dapat dilakukan uji ulang yang hanya membutuhkan beberapa menit saja.Hal itu membuat keefektifan kerja sangat cepat.

Kelemahan utama metode Bradford adalah reagen khususnya dapat mengakibatkan perbedaan respon tes untuk  jenisprotein yang berbeda. Hal itu membuat kita harus teliti dalam memilih protein yang akan di ujikan. Sebaiknya protein yang akan diuji ialah protein yang memberikan nilai absorbansi mendekati konsentrasi sampel protein yang diujikan. uji ini kurang akurat untuk  asam protein dasar.Selain itu kelemahan lainnya ialah kurangnya sensitivitasterhadap sampel yang hanya memiliki sedikit kandungan protein.(Bradford 1976)

Larutan Bovine Serum Albumin (BSA) merupakan larutan standar yang digunakan untuk menentukan kadar protein dengan metode Bradford (Keenan 1992) Berdasarkan percobaan yang telah dilakukan NaCl digunakan sebagai tamabahan pada larutan Bovine Serum Albumin (BSA) yang berfungsi sebagai pelarut protein yang akan diukur. Jika NaCl yang ditambahkan ke dalam larutan Bovine Serum Albumin (BSA) semakin banyak maka protein yang larut akan semakin banyak pula. Hal ini mengakibatkan pengompleksanantara protein dan zat warna Coomassie Brilliant Blue G-250dalam reagen Bradford akan semakin sedikit terjadi. Jadi, jika penambahan NaCl semakin banyak maka nilai absorbansi larutan tersebut semakin.(Khopkar 2007).

Berdasarkan percobaan yang telah dilakukan, praktikan menggunakan kurva standar yang digunakan untuk menentukan konsentrasi sampel yang nilai absorbansinya telah diketahui. Kurva standar tersebut ialah kurva hubungan antara konsentrasi larutan Bovine Serum Albumin (BSA)  dengan nilai absorbansinya yang ditentukan pada panjang gelombang 595 nm. Panjang gelombang yang digunakan 595 nm.Hal itu dikarenakan zat warna yang diikat oleh bagian hidrofobik protein ialah bentuk anionnya yang nilai absorbansi maksimumnya berada pada panjang gelombang terebut. (Bradford 1976)

Berdasarkan percobaan yang telah dilakukan, diperoleh data tabung ke-1, ke-2, ke-3 semakin meningkat nilai absorbansinya tetapi pada data tabung ke-4 nilai absorbansinya menurun lalu naik kembali pada tabung ke-5 dan ke-6. Pada tabung ke-1 yang berisi 100 µL larutan NaCl saja nilai absorbansinya 0,000 dengan konsentrasi protein 0,00 mg/mL. Tabung ke-2 yang berisi campuran antara larutan BSA 10 µL dan larutan NaCl 90 µL memiliki nilai absorbansi 0,168 dengan konsentrasi protein 0,10 mg/mL. Tabung ke-3 yang berisi campuran antara larutan BSA 20 µL dan larutan NaCl 80 µLmemiliki nilai absorbansi 0,210 dengan konsentrasi protein 0,20 mg/mL. Tabung ke-4 yang berisi campuran antara larutan BSA 30 µL dan larutan NaCl 70 µL memiliki nilai absorbansi 0,191 dengan konsentrasi protein 0,30 mg/mL. Tabung ke-5 diisi campuran antara larutan BSA 50 µL dan larutan NaCl 50 µLmemiliki nilai absorbansi 0,360 dengan konsentrasi protein 0,50 mg/mL. Tabung ke-6 diisi larutan BSA 100 µL sajamemiliki nilai absorbansi 0,925 dengan konsentrasi protein 1,00 mg/mL.Data hasil percobaan tidak sesuai dengan teori yang ada. Teori tersebut mengatakan bahwa jika NaCl yang ditambahkan pada larutan Bovine Serum Albumin (BSA) semakin banyak maka nilai absorbansinya akan semakin sedikit (kecil). (Bradford 1976) ketidaksesuaian tersebut dikarenakan adanya kesalahan saat melakukan percobaan seperti saat mengocok larutan, praktikan kurang kocok sehingga larutan kurang homogen dan mengakibatkan nilai absorbansinya menjadi menurun.

Persamaan garis yang diperoleh dari kurva standar yang menghubungkan antara nilai absorbansi dengan konsentrasi larutan Bovine Serum Albumin (BSA)   adalah Y= 0.003+0.873xdengan % r2 sebesar 95,92 %. Ketepatan data dapat dilihat dari nilai % r2 yang diperoleh. Hal tersebut dapat terjadi karena adanya kesalahan selama percobaan.Kesalahan tersebut seperti pada saat menambahkan larutan BSA dan larutan NaCl serta reagen Bradford terjadi tumpahnya larutan campuran tersebut saat mengocok agar larutan homogen dapat mengurangi jumlah protein di dalam larutan serta kesalahan pengkalibrasian spektrofotometer.Nilai absorbansi sampel ulangan pertama adalah sebesar0,311  dengan nilai konsentrasi sampel sebesar 0,3528 mg/mL. Nilai absorban sampel ulangan kedua adalah sebesar 0,353 dengan nilai konsetrasi sampel sebesar 0,4009 mg/mL.

Simpulan

Jadi dari percobaan yang telah dilakukan dapat disimpulkan bahwa metode Bradford ialah metode yang efektif digunakan dalam penentuan kadar protein pada larutan standar Bovine Serum Albumin (BSA) dengan zat warna Coomassie Brilliant Blue G-250. Metode Bradford ini mengandalkan kurva standar hubungan antara nilai absorbansi larutan dengan konsentrasi protein untuk menentukan konsentrasi larutan sampel dalam mg/mL.metode Bradford pada percobaan memiliki persamaan garis  y=0.003+0.873xdengan % r2 sebesar 95,92 %. Jika semakin banyak kontaminan (NaCl) yang ditambahkan ke dalam larutan Bovine Serum Albumin (BSA) maka semakin kecil nilai absorbansi larutannya.

Daftar Pustaka

Bradford, MM .1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of

microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analitical Biochemistry72 , 248-254.

Keenan, R. 1992. Biokimia Laboratorium. Jakarta : Erlangga.

Khopkar, S. 2007. Konsep Dasar Biokimia. Jakarta : UI Press.

Stoscheck, CM. 1990. Increased uniformity in the response of the Coomassie blue

protein assay to different proteins. Analitical Biochemistry 184,  111-116

Stoscheck CM .1990.Quantitation of Protein.Methods in Enzymology 182, 50

69.

 

 


Tinggalkan Balasan

Isikan data di bawah atau klik salah satu ikon untuk log in:

Logo WordPress.com

You are commenting using your WordPress.com account. Logout / Ubah )

Gambar Twitter

You are commenting using your Twitter account. Logout / Ubah )

Foto Facebook

You are commenting using your Facebook account. Logout / Ubah )

Foto Google+

You are commenting using your Google+ account. Logout / Ubah )

Connecting to %s

%d blogger menyukai ini: