devagerald

Just another WordPress.com site

laporan sfs fraksinasi inti sel dan mitokondria

Laporan Praktikum                             Hari tanggal    : Senin, 26 Maret 2012

Struktur Fungsi Subseluler                  Waktu             : Pukul 08.00 s.d 11.00 WIB

PJP                  : Ramdan Hidayat, M. Si

Asisten            : Dian Rahmawati

M. Iqbal AkMutaqqin

Annisa Rosiyana

 

 

 

 

FRAKSINASI SUBSELULER

(PREPARASI, ISOLASI FRAKSI INTI, DAN ISOLASI FRAKSI MITOKONDRIA)

 

 

 

 

 

Kelompok 7

Dwi Ayu Setianingrum                       G84100013

Ahmad Ajruddin M                            G84100018

 Lasma Eliezabeth                               G84100024

Deva Krisna Kadarani                      G84100036

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

DEPARTEMEN BIOKIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2012

 

Pendahuluan

Fraksinasi merupakan suatu proses pemisahan kuantitas tertentu dari campuran yang dapat dibagi dalam beberapa jumlah kecil (fraksi) komposisi perubahan berdasarkan kelandaian (Hendra 1989). Fraksinasi subseluler adalah suatu metode pemisahan sel dalam beberapa fraksi menjadi organel-organel seluler (Campbell 2002). Pemisahan ini berdasarkan bobot jenis dari tiap fraksi. Metode yang digunakan adalah sentrifugasi. Sentrifugasi merupakan suatu metode yang digunakan dalam pencapian sedimentasi dimana partikel-partikel yang ada dalam suatu bahan dipisahkan dari campurannya (Boyer 2000). Prinsip yang digunakan yaitu objek yang diputar secara horizontal pada jarak radial dari titik yang dikenakan gaya sentrifugal.

Berdasarkan prinsip yang biasa digunakan sentrifugasi terbagi menjadi dua macam yaitu yang pertama, berdasarkan massa, ukuran atau panjang partikel dan yang kedua, berdasarkan densitasnya. Sentrifugasi bergantung pada kekuatan sedimentasi atau pengendapan partikel dengan memanfaatkan massa, ukuran dan densitas partikel. Semakin cepat partikel mengendap maka semakin efektif  proses sentrifugasi. Kecepatan sedimentasi atau pengendapan ini ditentukan oleh beberapa hal yaitu berat molekul dan berat partikel. Semakin tinggi bobot molekulnya maka semakin tinggi pula kecepatanya. Berat partikel akan mempengaruhi gerakan partikel ketika disentrifugasi.(Yuwono, 2008)

Sentrifugasi pada umumnya ada dua macam yaitu sentrifugasi zonal dan keseimbangan gradien densitas. Sentrifugasi zonal yaitu sentrifugasi yang menggunakan massa partikel sebagai teknik untuk memisahkan molekul-molekul yang berbeda ukuran atau panjangnya dan setelah disentrifuasi partikel-partikel tersebut akan terpisah sesuai dengan ukurannya pada lapisan-lapisan atau zona-zona yang berbeda-beda. Sentrifugasi keseimbangan gradient densitas merupakan sentrifugasi yang biasanya menggunakan pelarut berupa sesium Klorida (CeCl) agar densitasnya bergradieb dari atas ke bawah dan setelah disentrifugasi partikel tersebut akan berada pada posisi yang mana densitas partikel seimbang sama dengan densitas pelarutnya. Prinsip sentriguasi ini dinamakan sentrifugasi keseimbangan gradient densitas karena antara partikel dan cairan(dalam hal ini sesium klorida) berada pada posisi keseimbangan densitas yaitu keadaan isopiknik. Sentrifugasi ini biasa digunakan untuk memisahkan molekul-molekul yang perbedaan densitasnya hingga 0,02 g/mL/ molekul-molekul tersebut seperti molekul protein, DNA, dan RNA yang densitasnya pada larutan sesium klorida ialah 1.3 g/mL , 1.6-1.7 g/mL, dan 1.75-1.8 g/mL.

 

Gambar. Sentrifugasi diferensial (Collen et al 1996)

 

 

Tujuan Percobaan

Praktikum ini bertujuan memahami prinsip fraksinasi subseluler, menangani hewan uji dan terampil mengisolasi organ dari hewan uji serta terampil melakukan fraksinasi subseluler untuk mengisolasi salah satu organel subseluler.

 

Alat dan Bahan

Alat yang digunakan dalam praktikum ini adalah sentrifus Beckman J2-21 dan tabung sentrifus. Alat-alat lainnya yang juga digunakan adalah labu erlenmeyer, botol pembius hewan uji, gunting, pinset, nampan, tabung vial, gelas ukur, pipet tetes, dan pipet volumetrik. Selain itu juga menggunakan neraca analitik, kain blacu, corong, dan homogenizer.

Bahan yang digunakan hati tikus dari galur Sprague Dawley. Larutan yang digunakan adalah larutan sukrosa 0.25 M-EDTA 1 mM, larutan sukrosa 0.34 M-EDTA 1 mM, dan larutan sukrosa 0.25 mM-CaCl2 3 mM dan eter.

 

Prosedur Percobaan

Praktikum kali ini fraksinasi subseluler melibatkan tiga tahapan, mulai dari preparasi, isolasi fraksi inti, dan isolasi fraksi mitokondria. Tahap preparasi telah dilakukan pada praktikum sebelumnya.

Sisa homogenat  yang ada dimasukkan ke dalam tabung sentrifus dan ditambahkan 0.34 M-EDTA 1 mM sebanyak 20 ml. Kemudian di sentrifugasi pada 700 g selama 10 menit. Supernatan dipindahkan untuk isolasi mitokondria dan pelet untuk isolasi fraksi inti.

Tahap isolasi fraksi inti, pelet disuspensikan dalam tabung dengan 10 ml sukrosa 0.25 mM-CaCl2 3 mM. Suspensi disaring dengan dua lapis kain blacu dan sisa partikel seluler dicuci dengan 10 ml sukrosa–CaCl2. Filtrat yang diperoleh disentrifus pada 1500 g selama 10 menit. Supernata yang didapat dibuang dan pelet disuspensikan kembali dengan 10 ml sukrosa-CaCl2. Suspensi yang didapat dibagi ke dalam empat buah vial dan disimpan dengan label fraksi inti.

Tahap isolasi fraksi mitokondria menggunakan supernatan yang didapat pada tahap preparasi. Supernatan yang membeku didiamkan hingga mencair kembali. Setelah supernatan cair, disentrifugasi pada 5000 g selama 15 menit. Kemudian, didapat supernatan dan pelet. Supernatan dibuang dan pelet dipindahkan ke tabung sentrifus lain dengan ditambahkan 10 ml larutan sukrosa 0.34 M-EDTA 1 mM. Pelet dihomogenasi dengan alat penggerus, setealh halus ditambahkan lagi larutan sukrosa yang sama sebanyak 20 ml. Pelet kembali disentrifugasi pada 24000 g selama 10 menit. Supernatan yang didapat dibuang dan pelet disentrifus kembali seperti langkah diatas. Pelet yang didapat disuspensikan kembali dalam 10 ml larutan sukrosa-EDTA dan disimpan dalam tabung vial dengan label fraksi mitokondria.

Hasil dan Pengolahan Data

Tabel 1 Data hasil isolasi fraksi inti tabel 2 fraksi mitokondria

Meja

 ke-

Bobot tabung kosong (gram)

Bobot tabung + isi

(gram)

Bobot fraksi inti

(gram)

1

6.3100

7.9700

1.6600

2

6.3100

18.0000

11.6900

3

7.6400

8.2900

0.6500

4

15.6900

37.4600

19.5600

5

16.5900

32.9600

20.8700

6

16.8351

36.2800

19.4449

7

16.8351

43.6000

26.7649

Contoh perhitungan :

Untuk meja ke-7

Bobot inti = ( Bobot tabung+ isi ) – (Bobot tabung kosong)

= 43.6000 gram – 16.8351 gram

=  26.7649 gram

Tabel 2. Data hasil isolasi fraksi mitokondria

Meja

 ke-

Bobot tabung kosong (gram)

Bobot tabung + isi

(gram)

Bobot mitokondria

(gram)

1

16.2600

19.0700

2.8100

2

15.7334

16.4100

0.6766

3

16.3500

19.0700

2.7200

4

15.6900

17.5400

1.8500

5

16.5900

32.9600

16.3700

6

15.4300

16.8900

1.4600

7

16.8351

16.8700

0.0349

Contoh perhitungan :

Untuk meja ke-7

Bobot mitokondria = ( Bobot tabung+ isi ) – (Bobot tabung kosong)

= 16.8700gram – 16.8351 gram

= 0.0349 gram

Pembahasan

Percobaan kali ini mengenai fraksinasi subseluler. Ada tiga tahapan dalam percobaan ini, mulai dari preparasi, isolasi fraksi inti, dan isolasi fraksi mitokondria. Prinsip dari percobaan ini adalah partikel yang tersuspensi akan mengendap ke dasar karena pengaruh gravitasi, juga didasarkan atas massa, ukuran, panjang partikel, dan densitas partikel (Rickwood 1984). Fraksionasi sel ini dapat digunakan untuk mempersiapkan komponen-komponen spesifik sel dalam jumlah besar untuk mengkaji komposisi dan fungsinya. ( Campbell 2000) Komponen spesifik yang ada pada percobaan ini ialah inti sel dan mitokondria. Kedua organel ini merupakan perpustakaan genetik yang dimiliki oleh sel eukariot. Hal itu dikarenakan keduanya memiliki struktur DNA yang mengontrol sistem kerja pada sel tersebut.

DNA yang berada pada inti sel diorganisasikan dengan protein menjadi materi yang dinamakan kromatin. Ketika terjadi pembelahan sel benang-benang kromatin kusut dan menggulung menjadi tebal memadat sehingga membentuk suatu struktur yang disebut dengan kromosom. Kromosom merupakan pengendali genetik pada sel eukariot. Selain itu, inti sel merupakan pengontrol dari kerja sintesis protein dalam sitoplasma. Proses kontrol tersebut dilakukan oleh inti sel dengan cara mengirimkan mRNA(Massenger Ribonukleotida Acid) ke sitoplasma untuk menyampaikan pesan genetik melalui pori-pori inti sel. Inti sel mensintesis mRNA ini sesuai dengan perintah dari DNA. Ketika molekul mRNA berada di sitoplasma, mRNA akan melekat pada ribosom dan pesan genetik yang dikirimkan akan segera diterjemahkan(ditranslasi) menjadi struktur primer protein spesifik. (Campbell et al 2000) Mitokondria merupakan suatu penghasil energi terbesar yang sangat diperlukan oleh sel untuk melakukan metabolisme sel melalui proses respirasi. Selain itu, mitokondria juga memiliki suatu ciri khas yang tidak dimiliki oleh organel sel lainnya yaitu memiliki DNA ekstrakromosom. DNA pada mitokondria memungkinkan terjadinya reproduksi melalui duplikasi DNA (pembelahan mitokondria). Pembelahan sel berbeda dengan pembelahan mitokondria. DNA yang ada pada mitokondria dapat digunakan untuk mensintesis protein di dalam organelnya sendiri. Meskipun pada akhirnya protein hasil sintesis mitokondria dikodekan oleh gen penyandi milik inti sel dan selanjutnya akan disintesis di ribosom sitoplasma yang akan dimasukkan kembali ke mitokondria dengan suatu proses yang sangat rumit.       (Collen et al 1996)

Fraksionasi sel dilakukan dengan menggunakan alat sentrifuse yang prosesnya dinamakan sentrifugasi. Sentrifugasi ini dilakukan berdasarkan perbedaan densitas molekul sel. Percobaan ini menggunakan sentrifugasi untuk pemisahannya. Prinsip kerja sentrifus adalah memisahkan substansi berdasarkan berat jenis molekul dengan cara memberikan gaya sentrifugal sehingga substansi yang lebih berat (pelet) akan berada di dasar sedangkan substansi yang lebih ringan (supernatan) akan terletak di atas. Teknik ini dapat digunakan untuk mengisolasi dan mengkarakterisasi molekul biologi juga komponen subseluler (Underwood 1998). Isolasi fraksi mitokondria dilakukan sentrifugasi sebanyak dua kali. Penyebabnya organel mitokondria yang kecil membutuhkan perbedaan kecepatan yang besar dalam sentrifugasi. Hal ini dikarenakan semakin kecil ukuran suatu komponen sel maka akan semakin sulit untuk mendapatkan fraksinya dan semakin besar kecepatan yang digunakan untuk mengisolasi komponen tersebut (Hendra 1989).

Berdasarkan perbedaan densitas tersebut, mitokondria yang memiliki densitas yang lebih rendah dibandingkan dengan inti sel. Hal itu terbukti dengan praktikum yang telah dilakukan dengan mensentrifugasi homogenat pada kecepatan 700 g dalam waktu 10 menit menghasilkan pellet yang di dalamnya terdapat inti sel sedangkan sentrifugasi supernatannya pada kecepatan 5000 g dalam waktu 15 menit menghasilkan pellet yang di dalmnya terdapat mitokondria. Berdasarkan prinsip ketergantungan laju pengendapan terhadap densitas, semakin berat densitas partikel maka semakin banyak diperlukan kecepatan dan waktu untuk mensentrifugasinya.

Berdasarkan praktikum yang telah dilakukan, data yang diperoleh untuk proses isolasi fraksi inti sel pada ketujuh meja praktikan berturut-turut sebagai berikut 1.6600 g, 11.6900 g, 0.6500 g, 19.5600 g, 20.8700 g, 19.4449 g, dan  26.7649 g.  data pada praktikum isolasi fraksi mitokondria pada ketujuh meja praktikan berturut-turut sebagai berikut 2.8100 g, 0.6766 g, 2.7200 g, 1.8500 g, 16.3700 g, 1.4600 g, dan 0.0349 g. Data pada praktikum kali ini yang tidak bersesuaian dengan teori bahwa densitas mitokondria lebih kecil dibandingkan dengan densitas yang dimiliki oleh inti sel yaitu data pada meja kesatu. Data tersebut menunjukkan bahwa bobot inti sel lebih kecil dibandingkan dengan bobot mitokondria yaitu 1.6600 g (bobot inti sel)  <  2.8100 g (bobot mitokondria). Densitas adalah bobot per volume, jika bobotnya kecil maka densitasnya akan kecil pula. Data yang berbeda dengan teori tersebut merupakan data yang didapat dengan atas dasar kesalah saat melakukan praktikum. Kesalahan tersebut seperti homogenat yang disentrifugasi untuk mendapatkan inti sel hanya sedikit sekali dibandingkan dengan larutan 0.34 M-EDTA 1 mM yang ditambahkan.

 

Simpulan

Metode yang digunakan untuk fraksinasi subseluler adalah sentrifugasi. Prinsip sentrifugasi pada percobaan ini berdasarkan perbedaan massa, ukuran, panjang partikel, dan densitas partikel. Sentrifugasi digunakan untuk mengisolasi dan mengkarakterisasi molekul biologi juga komponen subseluler yaitu inti sel dan mitokondria berdasarkan perbedaan densitas yang dimiliknya. Inti sel dan mitokondria memiliki DNA yang sangat penting untuk metabolism sel terutama sintesis protein. Densitas inti sel lebih besar dibandingkan dengan densitas mitokondria ditunjukkan dari bobot inti sel yang lebih besar dibandingkan dengan bobot mitokondria. Semakin kecil ukuran suatu komponen sel maka akan semakin sulit untuk mendapatkan fraksinya dan semakin besar kecepatan yang digunakan untuk mengisolasi komponen tersebut.

 

Daftar Pustaka

Boyer Rodney. 2000. Modern Instrumental of Biochemistry Third Edition. SanFrancisco: Addision Wesley Longman.

Campbell et al. 2000. Biologi Jilid Kesatu Edisi Kelima. Jakarta: Erlangga.

Collen et al. 1996. Biokimia Kedokteran Dasar : Sebuah Pendekatan Klinis. Joko Suyono, penerjemah. USA : Basic Medical Biochemistry: a Clinical Approach.

Evenhius E. 1978. Methods of Folair Analysis. Amsterdam: Institute Voor deAmsterdam.

Hendra A. 1989. Teknik Pemisahan dalam Analisis Biologis. Bogor: IPB Press.

Rickwood D. 1984. Centrifugation : a practical approach. Washington DC : IRLPress.

Underwood AL. 1998. Analisis Kimia Kuantitatif. Sofian, penerjemah. Jakarta :Erlangga.

Yuwono, Tribowo. 2008. Biologi Molekuler. Jakarta : Erlangga.

 

 

Tinggalkan komentar »

BRADFORD

Laporan Praktikum                                          Hari/Tanggal   : Senin,5 maret 2012

Struktur dan Fungsi Subseluler                        Waktu            : 08.00-11.00 Wib

PJP                 : Ramdan Hidayat, M.Si

Asisten           :    1. Affan Iqbal

2. An nisa Rosiyana

 

PENENTUAN PROTEIN

(METODE BRADFORD)

Kelompok 7A

Dwi Ayu Setianingrum          G84100013

Ahmad Ajruddin Munshif           G84100018

Lasma Elizabeth                     G84100024

Deva Krisna Kadarani         G84100036

 

 

 

 

 

 

 

 

DEPARTEMEN BIOKIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2012

 

Pendahuluan

Protein merupakan suatu zat yang sangat diperlukan oleh tubuh kita sebagai sumber energi untuk dapat melakukan aktivitas sehari-hari. Sehingga kita perlu mengetahui dan menentukan kadar protein di dalam tubuh kita. Penentuan kadar protein tersebut dapat dilakukan dengan berbagai cara yang salah satuya adalah metode Bradford.  Metode lain dalam menentukan kadar protein yang biasa digunakan adalah metode Lowry.

Metode Bradford ialah suatu metode yang dapat digunakan untuk menganalisis kandungan protein di dalam suatu larutan dengan menggunakan zat warna Coomassie Blue G-250 sebagai pengikat protein. (Bradford 1976) Zat warna tersebut akan mengikat protein dan mengubah warna pada larutan yang mengandung protein tersebut dari warna kemerahan menjadi warna kebiruan. Ikatan yang terjadi antara zat warna Coomassie Blue G-250 dan protein dapat terjadi dikarenakan adanya gaya van der walls antara keduanya. Gaya van der walls dapat terjadi karena adanya bagian protein yang bersifat hidrofobik mengikat bagian dari zat warna Coomassie Blue G-250( penyusun reagen Bradford) yang bersifat non polar sehingga mengakibatkan zat warna tersebut melepaskan elektronnya ke bagian hidrofobik protein. Selain itu, antara zat warna dan protein juga terdapat kekuatan ionik yang memperkuat  ikatan antara keduanya dan membuat zat warna tersebut menjadi stabil. Hal ini lah yang  digunakan pada metode Bradford untuk menentukan kadar protein di dalam suatu larutan. Kandungan protein yang berikatan dengan zat warna tersebut dapat diukur dengan menggunakan instrument spectronic 20 D untuk mengukur nilai absorbansnya pada panjang gelombang kisaran 465-595 nm. Selanjutnya, nilai absorbans tersebut dapat digunakan untuk membuat kurva standar yang menjadi dasar penentuan konsentrasi dan kadar protein di dalam larutan. (Bradford 1976)

Panjang gelombang yang digunakan untuk mengukur nilai absorbans larutan yang mengandung protein berkisar antara 470-650. Hal itu dikarenakan metode Bradford bergantung pada kerja zat warna Coomassie Blue G-250 yang memiliki empat formasi ion yang berbeda-beda dengan nilai pKa 1,15 ; 1,82 ; dan 12,4. Zat warna yang digunakan pada metode Bradford ini dapat dalam bentuk anion dan kation.Bentuk kation zat warna ini ialah dye commassie yang berwarna merah dan hijau dengan nilai absorbansi maksimum berada pada panjang gelombang kisaran 470 nm hingga 650 nm.Bentuk anion zat warna ini ialah commasie yang berwarna biru dengan nilai absorbansi maksimum berada pada panjang gelombang maksimum 595 nm. Penentuan kadar protein pada suatu larutan dilakukan dengan menentukan jumlah zat warna dalam bentuk anion (commasie blue G-250) yang diukur dengan panjang gelombang 595 nm.(Bradford 1976)

Tingkat ketelitian metode Bradford dlam menentukan kadar protein cukup tinggi karena koefisien penghentian dari kompleks albumin larutan standar BSA adalah konstan selama rentang konsentrasi flip-10. Nilai presisi dan akurasi data dari metode Bradford cukup tinggi dalam hal penentuan kadar protein ataupun sampel lain. Metode Bradford sangat sederhana, cepat dan teliti serta dapat dilakukan pengujian ulang untuk sampel lain yang berada di luar jangkauan. Oleh karena itu metode Bradford sangat dianjurkan untuk mendeteksi suatu molekul selular seperti protein. Metode ini menentukan kadar protein bukan dari ikatan peptidanya namun metode ini mendeteksi suatu asam amino spesifik yang berada di dalam protein tersebut dan berikatan dengan zat warnanya.( Stoscheck 1990)

Tujuan Percobaan

Percobaan ini bertujuan untuk menentukan kadar protein suatu sampel dengan metode Bradford  menggunakan instrumen spektrofotometer 20 D dan  kurva standar absorbansi.

Alat dan Bahan

Alat-alat yang digunakan dalam percobaan ini adalah spektronik 20, kuvet, pipet volumetrik, bulb, gelas piala, tabung reaksi, dan gelas ukur.Bahan – bahan yang digunakan adalah akuades, larutan Bovine Serum Albumin (BSA) 0.1 mg/mL, larutan NaCl, dan reagen Bradford.

Prosedur Percobaan

Sebelum praktikum dimulai, praktikan harus menginventarisasi alat terlebih dahulu. Enam tabung reaksi dibersihkan dan dikeringkan dan kemudian diberi label masing-masing tabung ke-1, ke-2, ke-3, ke-4, ke-5, dan ke-6. Tabung ke-1 diisi 100 µL larutan NaCl saja. Tabung ke-2 diisi campuranantara larutan BSA 10 µL dan larutan NaCl 90 µL. Tabung ke-3diisi campuran antara larutan BSA 20 µL dan larutan NaCl 80 µL. Tabung ke-4 diisi campuran antara larutan BSA 30 µL dan larutan NaCl 70 µL. Tabung ke-5 diisi campuran antara larutan BSA 50 µL dan larutan NaCl 50 µL. Tabung ke-6 diisi larutan BSA 100 µL saja. Sebanyak 5 mL reagen Bradford ditambahkan ke dalam masing-masing tabung reaksi. Kemudian semua tabung dikocok agar larutan menjadi homogen dan dibiarkan kurang lebih lima belas menit dengan penutup parafilm agar larutan tidak menguap. Tabung ke-1 digunakan sebagai blanko.Kemudian semua tabung reaksi tersebut diukur nilai absorbansnya dengan memasukkan larutan ke dalam kuvet dan diukur pada panjang gelombang 595 nm di spektrofotometer.Setelah itu dibuat kurva hubungan antara absorban dengan konsentrasi protein dalam tabung beserta persamaan garisnya.Kurva tersebut digunakan sebagai kurva standar.Larutan sampel protein dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan diukur nilai absorbansinya.Pengukuran absorbansi pada larutan sampel diulang sebanyak dua kali.Nilai absorbans yang diperoleh digunakan untuk menentukan konsentrasi sampel.Konsentrasi sampel ditentukan dengan memasukkan nilai absorban ke persamaan garis yang sudah diperoleh pada percobaan pertama.

Hasil Percobaan

Tabel.1 Kurva Standar BSA

Tabung [Konsentrasi] (mg/ml) Absorbansi
1 0.0 0.000
2 0.1 0.168
3 0.2 0.210
4 0.3 0.191
5 0.5 0.360
6 1.0 0.925

 

Contoh perhitungan:

M1.V1 = M2.V2

1 mg/mL 0.01 mL M2 0.1 mL

M20.1 mg/mL

 

 

 

Gambar 1. Kurva Standar BSA

Tabel 2. Pengamatan Sifat Fisik Larutan Koloid

Ulangan Absorbansi [Sampel] (mg/mL)
1 0.311 0.3528
2 0.353 0.4009

 

Contoh perhitungan:

Dari persamaan garis grafik di atas, diperoleh konsentrasi sampel sebagai berikut:

Y= a+bx

Y= 0.003+0.873x

0.311= 0.003+0.873x

X=  = 0.3528 mg/ml

Keterangan:

Y= absorbansi

X= Konsentrasi sampel

 

Pembahasan

Berdasarkan percobaan yang telah dilakukan metode Bradford dapat mendeteksi adanya kadar protein dengan menggunakan kurva standar hubungan antara absorbansi dan konsentrasi larutan sampel. Absorbansi maksimum ntuk larutan asam pewarna Coomassie Blue G-250 berada pada panjang gelombang kisaran 470 hingga 595 nm.Zat warna Coomassie Blue G-250 ini memiliki dua bentuk yaitu anion dan kation.Kation ialah zat warna merah Coomassiedab anion ialah zat warna biru Coomassie blue. Metode Bradford ini memiliki reagen khusus yaitu reagen Bradford. Reagen ini tersusun atas larutan 100 mg Coomassie Brilliant Blue G-250 dalam 50 ml etanol 95% dan 100 ml 85% (w/v) asam fosfat diencerkan hingga volume 1 L dengan aquades. Sebelum digunakan campuran penyusun reagen tersebut disaring oleh kertas saring whatman nomor satu dan disimpan dalam botol amber (gelap) pada suhu ruang agar tidak terbentuk endapan, reagen akan stabil setelah beberapa minggu penyimpanan dan bisa digunakan.(Bradford 1976)

Metode Bradford yang digunakan untuk menentukan kadar protein pada suatu larutan bergantung pada kurva standar yang dihasilkan dari absorbansi dan konsentrasi larutan yang mengandung protein tersebut. Prinsip dasar dari metode Bradford ini ialah pengikatan warnaCoomassie Blue G-250 (komponen penyusun reagen Bradford) oleh protein.Metode ini hanya digunakan untuk mendeteksi protein yang memiliki konsentrasi hingga 20 µL.

Keuntungan dari metode ini adalah pereaksi yang digunakan sangat sederhana serta mudah disiapkan.Selain itu kompleks warna biru pada larutan yang diberi reagen Bradford sangat cepat terbentuk dan bersifat stabil. Kestabilan warna biru coomassieini karena adanya inteaksi antara lapisan hidrofobik dari protein dengan bentuk anion dari zat warna Coomassie Brilliant Blue G-250 yang menstabilkan bentuk anion tersebut (adanya gaya van der walls). (Bradford 1976)Selain itu, uji Bradford juga sangat menguntungkan karena nilai akurasi dan presisi data yang didapatkan cukup tinggi serta untuk menjamin keakuratan data sampel yang berada di luar jangkauan dapat dilakukan uji ulang yang hanya membutuhkan beberapa menit saja.Hal itu membuat keefektifan kerja sangat cepat.

Kelemahan utama metode Bradford adalah reagen khususnya dapat mengakibatkan perbedaan respon tes untuk  jenisprotein yang berbeda. Hal itu membuat kita harus teliti dalam memilih protein yang akan di ujikan. Sebaiknya protein yang akan diuji ialah protein yang memberikan nilai absorbansi mendekati konsentrasi sampel protein yang diujikan. uji ini kurang akurat untuk  asam protein dasar.Selain itu kelemahan lainnya ialah kurangnya sensitivitasterhadap sampel yang hanya memiliki sedikit kandungan protein.(Bradford 1976)

Larutan Bovine Serum Albumin (BSA) merupakan larutan standar yang digunakan untuk menentukan kadar protein dengan metode Bradford (Keenan 1992) Berdasarkan percobaan yang telah dilakukan NaCl digunakan sebagai tamabahan pada larutan Bovine Serum Albumin (BSA) yang berfungsi sebagai pelarut protein yang akan diukur. Jika NaCl yang ditambahkan ke dalam larutan Bovine Serum Albumin (BSA) semakin banyak maka protein yang larut akan semakin banyak pula. Hal ini mengakibatkan pengompleksanantara protein dan zat warna Coomassie Brilliant Blue G-250dalam reagen Bradford akan semakin sedikit terjadi. Jadi, jika penambahan NaCl semakin banyak maka nilai absorbansi larutan tersebut semakin.(Khopkar 2007).

Berdasarkan percobaan yang telah dilakukan, praktikan menggunakan kurva standar yang digunakan untuk menentukan konsentrasi sampel yang nilai absorbansinya telah diketahui. Kurva standar tersebut ialah kurva hubungan antara konsentrasi larutan Bovine Serum Albumin (BSA)  dengan nilai absorbansinya yang ditentukan pada panjang gelombang 595 nm. Panjang gelombang yang digunakan 595 nm.Hal itu dikarenakan zat warna yang diikat oleh bagian hidrofobik protein ialah bentuk anionnya yang nilai absorbansi maksimumnya berada pada panjang gelombang terebut. (Bradford 1976)

Berdasarkan percobaan yang telah dilakukan, diperoleh data tabung ke-1, ke-2, ke-3 semakin meningkat nilai absorbansinya tetapi pada data tabung ke-4 nilai absorbansinya menurun lalu naik kembali pada tabung ke-5 dan ke-6. Pada tabung ke-1 yang berisi 100 µL larutan NaCl saja nilai absorbansinya 0,000 dengan konsentrasi protein 0,00 mg/mL. Tabung ke-2 yang berisi campuran antara larutan BSA 10 µL dan larutan NaCl 90 µL memiliki nilai absorbansi 0,168 dengan konsentrasi protein 0,10 mg/mL. Tabung ke-3 yang berisi campuran antara larutan BSA 20 µL dan larutan NaCl 80 µLmemiliki nilai absorbansi 0,210 dengan konsentrasi protein 0,20 mg/mL. Tabung ke-4 yang berisi campuran antara larutan BSA 30 µL dan larutan NaCl 70 µL memiliki nilai absorbansi 0,191 dengan konsentrasi protein 0,30 mg/mL. Tabung ke-5 diisi campuran antara larutan BSA 50 µL dan larutan NaCl 50 µLmemiliki nilai absorbansi 0,360 dengan konsentrasi protein 0,50 mg/mL. Tabung ke-6 diisi larutan BSA 100 µL sajamemiliki nilai absorbansi 0,925 dengan konsentrasi protein 1,00 mg/mL.Data hasil percobaan tidak sesuai dengan teori yang ada. Teori tersebut mengatakan bahwa jika NaCl yang ditambahkan pada larutan Bovine Serum Albumin (BSA) semakin banyak maka nilai absorbansinya akan semakin sedikit (kecil). (Bradford 1976) ketidaksesuaian tersebut dikarenakan adanya kesalahan saat melakukan percobaan seperti saat mengocok larutan, praktikan kurang kocok sehingga larutan kurang homogen dan mengakibatkan nilai absorbansinya menjadi menurun.

Persamaan garis yang diperoleh dari kurva standar yang menghubungkan antara nilai absorbansi dengan konsentrasi larutan Bovine Serum Albumin (BSA)   adalah Y= 0.003+0.873xdengan % r2 sebesar 95,92 %. Ketepatan data dapat dilihat dari nilai % r2 yang diperoleh. Hal tersebut dapat terjadi karena adanya kesalahan selama percobaan.Kesalahan tersebut seperti pada saat menambahkan larutan BSA dan larutan NaCl serta reagen Bradford terjadi tumpahnya larutan campuran tersebut saat mengocok agar larutan homogen dapat mengurangi jumlah protein di dalam larutan serta kesalahan pengkalibrasian spektrofotometer.Nilai absorbansi sampel ulangan pertama adalah sebesar0,311  dengan nilai konsentrasi sampel sebesar 0,3528 mg/mL. Nilai absorban sampel ulangan kedua adalah sebesar 0,353 dengan nilai konsetrasi sampel sebesar 0,4009 mg/mL.

Simpulan

Jadi dari percobaan yang telah dilakukan dapat disimpulkan bahwa metode Bradford ialah metode yang efektif digunakan dalam penentuan kadar protein pada larutan standar Bovine Serum Albumin (BSA) dengan zat warna Coomassie Brilliant Blue G-250. Metode Bradford ini mengandalkan kurva standar hubungan antara nilai absorbansi larutan dengan konsentrasi protein untuk menentukan konsentrasi larutan sampel dalam mg/mL.metode Bradford pada percobaan memiliki persamaan garis  y=0.003+0.873xdengan % r2 sebesar 95,92 %. Jika semakin banyak kontaminan (NaCl) yang ditambahkan ke dalam larutan Bovine Serum Albumin (BSA) maka semakin kecil nilai absorbansi larutannya.

Daftar Pustaka

Bradford, MM .1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of

microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analitical Biochemistry72 , 248-254.

Keenan, R. 1992. Biokimia Laboratorium. Jakarta : Erlangga.

Khopkar, S. 2007. Konsep Dasar Biokimia. Jakarta : UI Press.

Stoscheck, CM. 1990. Increased uniformity in the response of the Coomassie blue

protein assay to different proteins. Analitical Biochemistry 184,  111-116

Stoscheck CM .1990.Quantitation of Protein.Methods in Enzymology 182, 50

69.

 

 

Tinggalkan komentar »

control panel

Tugas Penkom

Nama : Deva Krisna Kadarani

Nim    : G84100036

Prodi  : S1-Biokimia

CONTROL PANEL

 

Control Panel adalah sebuah folder khusus yang berisi alat-alat (sistem perangkat lunak) yang digunakan untuk mengkonfigurasi perangkat keras dan perangkat lunak. Misalnya, Anda dapat menyesuaikan mouse, keyboard, printer, menambah atau menghapus perangkat keras atau program dan juga mengatur tampilan desktop menggunakan skema warna, screen saver dll Semua peralatan dalam Kontrol Panel akan disimpan dengan ekstensi CPL.

Anda dapat menemukan semua CPL file di dalam C: \ Windows \ system32 folder dengan mencari ekstensi*.cpl.
Karena itu, Anda dapat membuat komputer Anda lebih aman untuk menyembunyikan beberapa alat penting dari control panel, karena Anda dapat mencegah pengguna lain untuk membuat perubahan apapun di komputer Anda dengan menggunakan alat Control Panel.

  1. 1.   APPEARANCE AND THEME

Appearance and themes  Berfungsi sebagai pengubah tampilan pada deskop, mengatur tema, screensaver, serta tampilan icon. Di dalam appearance and themes terdapat :

1. Display
Di dalam menu display terdapat menu themes untuk mengatur tema, deskop untuk mengatur tampilan pada deskop, screensaver, appearance untuk mengubah tampilan pada saat membuka folder, dan setting untuk mengatur penggunaan resolusi pada layar.
2. folder optionMengatur tampilan, tipe jenis folder pada computer.
3. taskbar and startmenuSesuai namanya berfungsi sebagai pengatur tampilan pada taskbar dan start menu

  1. NETWORK AND INTERNET CONNECTIONS

 

 

Network and internet connection Di dalam menu ini terdapat :
1. internet option

berfungsi sebagai pengaturan umum pada koneksi internet serta pengaturan program dan atribut pada internet.
2. Bluetooth device
Berfungsi sebagai Enkripsi data, Autentikasi user , Fast frekuensi-hopping (1600 hops/sec), dan Output power control
3. Wireless Network setup wizard

Berfungsi sebagai pengaturan jaringan melalui koneksi
wireless.
4. Network connection
Berfungsi sebagai pengaturan koneksi yang digunakan pada computer.
5. Windows firewall

Berfungsi sebagai pelindung computer pada saat terjadi hubungan via internet.

 

  1. ADD OR REMOVE PROGRAMS

 

 

add and remove program
Berfungsi sebagai tempat menambahkan atau menghapus suatu program di dalam dan ke dalam computer.

 

  1. SOUNDS, SPEECH, AND AUDIO DEVICES

 

 

sound, speech, and audio devices
Berfungsi sebagai pengakuran suara yang di input dan di output dari dank e dalam computer melalui perangkat keras (hardware).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

  1. PERFORMANCE AND MAINTENANCE

 

 

performance and maintence di dalam nya terdapat :
1. administrative tools

Berfungsi sebagai pengaturan administrative pada computer.
2. power option

Pengaturan penyimpoanan energy pada computer.

 
3. systemSebagai daerah untuk mengetahui jenis spesifikasi yang digunakan pada computer, nama computer, jenis hardware yang digunakan, serta pengaturan performance pada computer.
4. Scheduled tasks
Pengaturan task pada computer untuk bekerja secara otomatis.

 

  1. PRINTERS AND OTHER HARDWERE

 

 

printers and other hardware di dalamnya terdapat :

1. game controllerBerfungsi sebagai penambah dan pengaturan hardware penunjang untuk game pada pc seperti joystick.
2. Mouse

Berfungsi sebagai pengatur tampilan kinerja serta ke sensitifan pada mouse.

 
3. phone and modem option

Berfungsi sebagai pengatur sambungan telepon dan sambungan modem ke dalam computer.
4. scanners and cameras
Berfungsi sebagai pengatur penambahan hardware untuk scanner dan camera atau sejenisnya ke dalam computer.

 

5. keyboardBerfungsi sebagai pengatur penggunaan pada keyboard.
6. Printers and faxes
Berfungsi sebagai pengaturan hardware printer atau sejenisnya.

 

  1. USER ACCOUNTS

 

 

user account
Berfungsi sebagai pengaturan pangguna computer seperti pemberian password.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

  1. DATE, TIME, LANGUAGE,AND REGIONAL OPTION

 

 

date, time, language, and regional option
Berfungsi sebagai pengaturan tanggal, waktu, bahasa, serta zona wilayah yang digunakan pada computer.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

  1. ACCESSIBILITY OPTIONS

 

 

accessibility option
Berfungsi sebagai pengaturan pandangan, pendengaran atau pengeluaran suara serta kinerja computer.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

10. WINDOWS SECURITY CENTER

Berfungsi sebagai pengaturan perangkat pelindung di dalam computer.

 

-general        :  untuk melihat format hardisk (ntfs), untuk melihat kapasitas hardisk

 

-tools            :  – error-checking  buat ngechek di hardisk ada yang error

– defragmentation buat menyusun data yang ada di hardisk

– backup buat data cadangan jika data hilang

 

-hardware    : buat melihat semua yang ada di computer

 

 

-sharing        : buat ngeshared data

 

-security       : buat keamanan user

 

-Quota           : buat batas kapasitas data hardisk

 

 

General : data computer

 

Computer name : nama komputer

-network ID : buat jaringan LAN

– change       : buat join ke dalam jaringan

 

 

Hardware  : (alat keras) buat ngeliat data yang ada di computer

 

Advanced :  -performance buat settings memory

-user profiles buat settings destop pada user

-startup and recovery  buat settings starup computer

 

System properties  :  settings  space hardisk

 

Automatic updates   : buat updates windows jika perlu

 

Remote   :  buat pengendali jarak jauh

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Tinggalkan komentar »

spektrofotometri

Laporan Praktikum                                          Hari/Tanggal   : Senin, 20 Februari 1012

Struktur dan Fungsi Subseluler                        Waktu            : 08.00-11.00 Wib

PJP                 : Ramdan Hidayat, M.Si

Asisten           : Didit Haryadi

G84080081

PENGENALAN ALAT-ALAT LABORATORIUM

(SPEKTROFOTOMETER)

 

Kelompok 7A

Dwi Ayu Setianingrum          G84100013

Ahmad Ajruddin Munshif           G84100018

Lasma Eliezabeth                   G84100024

Deva Krisna Kadarani            G84100036

DEPARTEMEN BIOKIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2012

Pendahuluan

Spektrofotometer merupakan alat yang digunakan untuk mengukur absorbansi dengan cara melewatkan cahaya dengan panjang gelombang tertentu pada suatu obyek kaca atau kuarsa yang disebut kuvet. Sebagian dari cahaya tersebut akan diserap dan sisanya akan dilewatkan. Nilai absorbansi dari cahaya yang dilewatkan akan sebanding dengan konsentrasi larutan di dalam kuvet (Cairns 2009).

Spektrofotometer sangat berhubungan dengan pengukuran jauhnya pengabsorbansian energi cahaya oleh suatu sistem kimia sebagai fungsi panjang gelombang dengan absorban maksimum dari suatu unsur senyawa. Konsentrasi unsur atau senyawa dapat dihitung menggunakan kurva standar yang diukur pada panjang gelombang absorban tertentu, yaitu panjang gelombang yang diperoleh dari hasil nilai absorbansi yang tertinggi. Spektrum absorban selain bergantug pada sifat dasar kimia, juga bergantung pada faktor-faktor lain. Larutan pembanding dalam spektrofotometri pada umumnya adalah pelarut murni atau suatu larutan blanko yang mengandung sedikit zat yang akan ditetapkan atautidak sama sekali (Day & Underwood 1998).

Spektofotometer banyak digunakan dalam penentuan konsentrasi suatu larutan. Secara umum spektrofotometer dibedakan menjadi empat macam, yaitu spektrofotometer ultraviolet, spektrofotometer sinar tampak, spektrofotometer infra merah dan spektrofotometer serapan atom. Spektrofotometer bekerja dengan cara mengukur banyaknya cahaya yang melewati suatu sampel yang akan diserap atau diteruskan (Keenan 1992).

Unsur-unsur terpenting suatu spektrofotometer yakni sumber energi radiasi yang kontinu dan meliputi daerah spektrum untuk dijalankannya. Unsur terpenting lainnya yakni monokromator yang merupakan suatu alat untuk mengisolasi suatu berkas sempit dari panjang gelombang spektrum luas yang disiarkan oleh sumber. Selain itu wadah untuk contoh dan detektor yang merupakan suatu transducer yang mengubah energi radiasi menjadi isyarat listrik, serta penguat dan rangkaian yang membuat isyarat listrik cocok untuk diamati. Sistem pembacaan dapat mempertunjukkan besarnya isyarat listrik (Harjadi 1993)

Suatu spektrofotometer standar terdiri atas spektrofotometer untuk menghasilkan cahaya dengan panjang gelombang terseleksi yaitu bersifat monokromatik serta suatu fotometer yaitu suatu piranti untuk mengukur intensitas berkas monokromatik. Penggunaan spektrofotometer memiliki beberapa kelebihan yakni dapat digunakan secara luas, memiliki kepekaan yang tinggi, tingkat selektifitas baik, dan ketelitian tinggi (Khopkar 2007).

Metode analisa menggunakan spektrofotometer disebut spektrofotometri. Spektrofotometri merupakan suatu metoda analisa yang didasarkan pada pengukuran serapan sinar monokromatis oleh suatu lajur larutan berwarna pada panjang gelombamg spesifik dengan menggunakan monokromator prisma atau kisi difraksi dengan detektor fototube. Benda bercahaya seperti matahari atau bohlam listrik memancarkan spektrum yang lebar terdiri atas panjang gelombang. Panjang gelombang yang dikaitkan dengan cahaya tampak itu mampu mempengaruhi selaput pelangi mata manusia dan karenanya menimbulkan kesan subyektif akan ketampakan (vision). Dalam analisis secara spektrofotometri terdapat tiga daerah panjang gelombang elektromagnetik yang digunakan, yaitu daerah UV  (200 – 380 nm), daerah visible (380 – 700 nm), daerah inframerah (700 – 3000 nm) (Khopkar 1990).

 

Tujuan

Praktikum kali ini bertujuan agar mahasiswa dapat memahami prinsip kerja dari spektrofotometer dan membuat kurva standar untuk pengukuran sampel dengan spektrofotometer.

 

Alat dan Bahan

Peralatan yang digunakan yaitu spektronic 20, pipet volumetrik, bulb, tabung reaksi beserta raknya, gelas piala, labu takar, dan kuvet. Sedangkan bahan yang digunakan yaitu larutan metilen biru dari konsentrasi  103 M, 10-4M, 8×10-5 M, 6×10-5 M, 4×10-5 M, dan 2×10-5 M,  serta aquades.

 

 

 

Prosedur Percobaan

Terlebih dahulu dibuat larutan biru metilen dengan konsentrasi 10-4M, 8×10-5 M, 6×10-5 M, 4×10-5 M, dan 2×10-5 M dari larutan biru metilen konsentrasi 103 M dengan metode pengenceran. Sementara itu, spektronic 20 yang akan digunakan dinyalakan dengan menggunakan tombol POWER/ZERO dan dibiarkan selama 15 menit untuk pemanasan alat. Panjang gelombang diatur pada 600-680 nm. Kemudian, wadah sampel kosong dimasukkan untuk ditentukan nilai 0% T. Lalu dimasukkan blanko ke dalam sampel setelah meter menunjukan absorban pada 0 (100% Transmitan). Selanjutnya, larutan metilen biru ditentukan nilai absorbansinya dari konsentrasi 104 M untuk mengetahui nilai panjang gelombang maksimum. Kemudian pengukuran nilai absorbansi dilanjutkan dengan pengukuran larutan metilen biru dari konsentrasi terendah hingga konsentrasi paling tinggi.

 

Hasil dan Pembahasan

Table 1. Nilai absorbansi metilen biru pada λ600-680 nm

Larutan Konsentrasi (M) λ (nm) Absorbansi
Metilen biru 104 600 2,089
    610 2,134
    620 2,040
    630 2,013
    640 2,049
    650 2,136
    660 2,082
    670 1,708
    680 1,073

 

Tabel.2 Nilai Absorbansi Metilen Biru pada λ  650 nm

Konsentrasi (M) Absorbansi
10-4 2,650
8×105 1,340
6×105 1,152
4×105 1,115
2×105 0,337

 

Contoh Perhitungan :

V1x M1= V2x M2

10-3x V1= 10-4x 10 ml

V1= 1 ml

 

Pembahasan

Berdasarkan percobaan yang telah dilakukan, percobaan ini membahas mengenai instrument penting dalam ilmu biokimia yaitu spektrofotometer. Spektrofotometer merupakan alat yang digunakan untuk mengukur absorbansi dengan cara melewatkan cahaya dengan panjang gelombang tertentu pada suatu obyek kaca atau kuarsa yang disebut kuvet.

Sebagian dari cahaya tersebut akan diserap dan sisanya akan dilewatkan. Mula-mula zat yang akan diukur diidentifikasi, berupa atom atau molekul. Radiasi dari sumber infra merah dipecah oleh pencacah sinar menjadi dua bagian yang sama dengan arah yang saling tegak lurus. Setelah itu, kedua radiasi tersebut dipantulkan kembali ke dua cermin sehingga bertemu kembali di pencacah sinar untuk berinteraksi. Sebagian sinar diarahkan ke sampel lalu ke detektor sedangkan sebagian lagi dibalikkan ke sumber gerak. Maju mundur cermin akan menyebabkan sinar yang menuju detektor berfluktuasi tetapi terkendali (Okkeus 2008). Nilai absorbansi dari cahaya yang dilewatkan akan sebanding dengan konsentrasi larutan di dalam kuvet. Prinsip percobaan ini ialah menentukan konsentrasi sampel dengan menggunakan kurva standar biru metilen yang menghubungkan konsentrasi dengan nilai absorbannya. Kontras komplementer adalah dua warna yang saling berseberangan (memiliki sudut 180°) di lingkaran warna. Dua warna dengan posisi kontras komplementer menghasilkan hubungan kontras paling kuat. Misalnya jingga dengan biru berdasarkan lingkar warna Goethe (Goethe 1995). Warna kontras komplementer inilah yang diserap oleh spektrofotometer dalam bentuk cahaya monokramatik pada biru metilen.

Pada percobaan kali ini, praktikan diminta untuk menentukan panjang gelombang maksimum yang dapat dipakai oleh larutan sampel yaitu biru metilen. Panjang gelombang maksimum ditentukan agar praktikan mengetahui waktu absorpsi mencapai maksimum. Sehingga waktu tersebut dapat digunakan untuk meningkatkan proses absorpsi larutan sampel (biru metilen) terhadap sinar (Rohman 2007).  Dari percobaan ini diperoleh data bahwa dari kisaran panjang gelombang maksimum yang dari 600 nm sampai dengan 680 nm, pada panjang gelombang 650 nm merupakan panjang gelombang maksimum yang dimiliki oleh sampel. Hal itu dikarenakan pada panjang gelombang tersebut nilai absorbansinya ialah sebesar 2,136. Meskipun berbeda dari literatur yang mengatakan bahwa panjang gelombang maksimum pada biru metilen ialah sebesar 660 nm, namun pada percobaan ini nilai absorbansinya lebih rendah yaitu 2,082 (Cahyanto 2008). Hal tersebut dapat disebabkan oleh beberapa hal seperti pada saat melakukan praktikum seharusnya setiap kali pergantian panjang gelombang kita harus mengkalibrasi alat untuk presisi yang lebih tinggi. Selain itu, pada percobaan tersebut larutan yang ada diukur nilai absorbansinya pada setiap panjang gelombang harus diganti (tidak boleh menggunakan larutan sampel yang sama). Hal itu akan mengakibatkan ketelitian nilai absorbansinya berkurang, sebab larutan tadi telah dilewati oleh berkas cahaya monokromatik secara radiasi yang akan mempengaruhi nilai absorbansi yang sebenarnya.

Hubungan antara konsentrasi sampel dan nilai absorbansi dapat kita lihat dari hasil percobaan yang telah dilakukan yaitu berbanding terbalik. Seiring dengan meningkatnya konsentrasi larutan biru metilen, nilai absorbansinya semakin menurun. Hal itu terlihat pada data yang memiliki kurva dengan persamaan garis y = 0,4851 x – 0,1365 dan R2 = 0,8387 (sumbu y adalah nilai absorbansi dan sumbu x adalah konsentrasi sampel). Dari nilai R2 yang bernilai 0,8387 ini kita dapat mengetahui nilai presisi dari percobaan ini ialah sebesar 83,87 %. Beer menemukan hubungan antara konsentrasi dari suatu konstituen berwarna yang terdapat dalam larutan dengan transmisi cahaya. Berkas cahaya monokromatik yang melewati suatu larutan sampel yang berkonsentrasi tinggi akan menurunkan nilai intensitas cahaya yang berhasil tembus pada sampel tersebut secara eksponensial. Hal itu akan membuat nilai dari absorbansi akan meningkat secara aritmatik (Harjadi 1993).

 

Simpulan

Jadi, dari percobaan yang telah dilakukan, kita dapat menggunakan metode spektrofotometri yang merupakan instrument yang dapat digunakan untuk menghitung absorbansi suatu sampel dalam hal ini berupa larutan biru metilen. Metode ini harus menggunakan panjang gelombang yang tepat untuk memperoleh nilai absorbansi dengan presisi tinggi yaitu panjang gelombang maksimum yang berada pada 650 nm pada larutan biru metilen ini. Data hasil percobaan yang berupa nilai absorbansi biru metilen digunakan sebagai kurva standar yang menghubungkan antara konsentrasi dan absorbannya. Selanjutnya kurva standar digunakan untuk menghitung konsentrasi sampel yang belum diketahui konsentrasinya. Sebab kurva standar tersebut menjelaskan hubungan antara konsentrasi yang berbanding terbalik yaitu semakin tinggi konsentrasinya maka nilai absorbansinya akan semakin rendah.

 

Daftar Pustaka

Cairns D. 2009. Intisari Kimia Farmasi Edisi Kedua. Penerjemah : Puspita Rini.

Jakarta : Penerbit Buku Kedokteran EGC. Terjemahan dari : Essentials of Pharmaceutical Chemistry Second Edition.

 

Day R dan Underwood A. 2002. Analisis Kimia Kuantitatif Edisi Keenam.

Penerjemah : Sopyan Iis. Jakarta : Erlangga. Terjemahan dari : Quantitative Analysis Sixth Edition.

 

Harjadi, W. 1993. Ilmu Kimia Analitik Dasar. Jakarta: Gramedia

Keenan,W. Charles. 1992. Kimia Untuk Universitas Jilid 1. Erlangga. Jakarta.

Khopkar, S. 2007. Konsep Dasar Kimia Analitik. Jakarta : Universitas Indonesia Press

Goethe, Johann , Miller, Douglas. 1995. Scientific Studies (Goethe: The Collected Works, Vol. 12), p.57. Jerman : Princeton University Press.

Tinggalkan komentar »

laporan sentrifus

Laporan Praktikum                                          Hari/Tanggal   : Senin, 27 Februari 1012

Struktur dan Fungsi Subseluler                        Waktu            : 08.00-11.00 Wib

PJP                 : Ramdan Hidayat, M.Si

Asisten           : 1. Elsa May Susanti

2. Didit Haryadi

3. Tati Hasniyati

PENGENALAN ALAT-ALAT LABORATORIUM

(PH METER DAN SENTRIFUSA)

 

Kelompok 7A

                   Dwi Ayu Setianingrum          G84100013

Ahmad Ajruddin Munshif           G84100018

Lasma Elizabeth                     G84100024

Deva Krisna Kadarani            G84100036

 

DEPARTEMEN BIOKIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2012

Pendahuluan

Sentrifugasi adalah metode sedimentasi untuk memisahkan partikel-partikel dari suatu fluida berdasarkan berat jenisnya dengan memberikan gaya sentripetal (Robinson 1975). Sentrifugasi bertujuan untuk memisahkan sel menjadi organel-organel utama sehingga fungsinya dapat diketahui (Miller 2000). Dalam bentuk yang sederhana sentrifus terdiri atas sebuah rotor dengan lubang-lubang untuk melatakkan wadah/tabung yang berisi cairan dan sebuah motor atau alat lain yang dapat memutar rotor pada kecepatan yang dikehendaki. Semua bagian lain yang terdapat pada sentrifus modern saat ini hanyalah perlengkapan yang dimaksudkan untuk melakukan berbagai fungsi yang berguna dan mempertahankan kondisi lingkungan dimana rotor tersebut bekerja.  Penggunaan sentrifus cukup luas, meliputi koleksi dari pemisahan sel, organel dan molekul  (Hendra 1989).

Prinsip sentrifus bekerja seperti komedi putar. Prinsipnya yakni dengan meletakkansampel pada suatu gaya dengan memutar sampel pada kecepatan tinggi, sehingga terjadi pengendapan partikel, atau organel-organel sel berdasarkan bobot molekulnya (Artika 2010). Substansi yang lebih berat akan berada di dasar, sedangkan substansi yang lebih ringan akan terletak di atas (Miller 2000). Substansi hasil sentrifugasi terbagi menjadi dua, yaitu supernatan dan pelet. Supernatan adalah substansi hasil sentrifugasi yang memiliki bobot jenis yang lebih rendah. Posisis dari substansi ini berada pada lapisan atas dan warnanya lebih jernih. Sementara pelet adalah substansi hasil sentrifugasi yang memiliki bobot jenis yang lebih tinggi. Posisisnya berada pada bagian bawah (berupa endapan) dan warnanya lebih keruh.

Alat pengukur derajat keasaman (pH meter) ialah alat digital yang digunakan untuk mengukur pH. Prinsipnya menggunakan satuan ukur yang menguraikan derajat keasaman atau kadar alkali dari suatu larutan. Standarisasi pH meter menggunakan larutan buffer dengan menggunakan larutan yang belum diketahui nilai pHnya. Semua pH meter memiliki kenop berlabel pengatur suhu yang digunakam untuk mengukur temperature dari larutan yang diukur (Bernasconi). pH meter memiliki dua buah elektroda, yaitu elektroda gelas dan elektroda kalomel. Elektroda gelas terdiri dari bola yang sangat tipis dengan ketebalan 0,1 mm yang terdapat pada ujung pipa gelas yang kuat dengan daya tahan tinggi. Bola tersebut mengandung HCl (0,1 mol/liter) yang dihubungkan dengan kawat platina melalui elektroda Ag  (Robinson 1975). Elektroda gelas di dalam larutan yang diukur menyusun setengah sel dan rangkaian pengukur dilengkapi dengan elektrode acuan yang tidak sensitif terhadap ion hidrogen. Elektroda acuan yang biasa digunakan adalah elektroda kalomel. Elektroda kalomel bersifat stabil, mudah digunakan, dan memiliki ketepatan tinggi dalam menentukan potensial elektroda standar (Hendra 1989).

Prinsip penggunaan pH meter adalah berdasarkan pada potensial elektrokimia yang terjadi antara larutan yang terdapat dalam elektroda gelas (membran gelas) yang telah diketahui dengan larutan di luar elektroda gelasyang tidak diketahui sebelumnya. Hal ini disebabkan oleh lapisan tipis dari gelembung kacaakan berinteraksi dengan ion hidrogen yang ukurannya relatif lebih kecil dan aktif, sehinggaelektroda tersebut akan mengukur potensial elektrokimia dari ion hidrogen. Sirkuit elektrik harus dilengkapi dengan elektroda pembanding (kalomel). Hal yang harus digaris bawahi adalah alat tersebut tidak mengukur arus tetapi hanya mengukur tegangan (Bernasconi 1995).

 

Tujuan Percobaan

Percobaan ini bertujuan untuk memperkenalkan prinsip kerja dan cara penggunaan alat–alat laboratorium di laboratorium biokimia. Alat-alat tersebut meliputi pH meter dan sentifusa.

 

Alat dan Bahan

Alat-alat yang digunakan dalam percobaan ini meliputi pH meter gelas, alat sentrifus, tabung sentrifus, labu takar 50 ml, gelas piala 100 ml, gelas piala 200 ml, pipet volumetrik, pipet tetes, labu erlenmeyer dan beker gelas.

Bahan yang digunakan pada praktikum kali ini adalah aquades, suspensi kloroplas, Na2HPO4, asam sitrat serta  bufer pH 7 dan 4.

Prosedur Percobaan

Pada percobaan penggunaan pH meter, disiapkan masing-masing 50 ml larutan 0,2 M fosfat (Na2HPO4.2H2O) dan 50 ml 0,1 M sitrat. Selanjutnya melakukan standarisasi terhadap pH meter. Dicampurkan 17,5 ml larutan fosfat ke dalam 32,5 ml larutan sitrat, lalu pHnya diukur. Bila pH < 3,8 maka asam sitrat ditambahkan dengan pipet tetes hingga pH menyentuh angka 4. Namun bila pH > 3,8 maka fosfat yang bersifat basa ditambahkan  dengan pipet tetes hingga pH menyentuh angka 7.

Pada percobaaan penggunaan sentrifus, memindahkan suspensi kloroplas ke dalam satu tabung dingin yang ada dalam bak es. Sebelum suspensi dimasukkan, terlebih dahulu tabung kosong ditimbang dengan menggunakan neraca. Selanjutnya suspensi kloroplas dimasukkan dan tabung yang berisi kloroplas di timbang kembali. Ada tiga tabung yang berisi suspensi kloroplas yang digunakan dalam percobaan kali ini dan sebagai penyeimbang menggunakan air untuk mengisi tabung lainnya. Perbedaan bobot kedua tabung ini harus harus tidak lebih dari 100 mg. Selanjutnya tabung tersebut diberi label. Tabung kemudian diletakkan di dalam rotor pada posisi yang berlawananhingga tabung berada dalam keadaan seimbang. Selanjutnya memutar alat sentrifus dengan kecepatan 1200 g selama 10 menit. Setelah selesai menuangkan supernatannya dengan hati-hati ke dalam wadah lain, sehingga tidak tercampur dengan pelet.

 

Hasil Percobaan

Tabel 1. Bobot pelet kloroplas

Sampel Bobot tabung kosong (g) Bobot tabung kosong+ kloroplas (g) Bobot tabung+ pellet (g) Bobot suspensi kloroplas Bobot pelet (g)  

Rendemen

(% b/b)

 

1 15,88 34,68 21,71 18,80 5,83 0,3072
2 15,63 34,85 20,81 19,22 5,18 0,2695
3 15,70 34,77 20,51 19,07 4,81 0,2522

Contoh perhitungan :

Bobot pelet = (bobot tabung + bobot pllet) – bobot tabung = 21,71 – 15,88 = 5,83

RCF = 1,12 x r x

1200 = 1,12 x 10-5x 7 cm x

RPM = 3912,3039  4000

Keterangan :

RCF     : relative centrifugal force = gaya sentrifugasi yang dihasilkan dibandingkan   dengan percepatan gravitasi bumi

RPM    : rotasi per menit

r           : jari-jari rotor

Tabel 2. Penggunaan pH meter

Sampel pH terukur pH Universal
Sampel 1 4,43 4
Sampel 2 4,31 4
Sampel 3 5,58 6
Sampel 4 7,31 7
Sampel 5 4,55 4

 

Contoh perhitungan:

Pembuatan larutan asam sitrat 0,1 M

M= x

0,1 M =  x

gr=  = 1, 0507 gr

Pembuatan larutan asam fosfat 0,1 M

M= x

0,2 M =  x

gr=  = 3,5814 gr

 

Pembahasan

Prinsip sentrifugasi didasarkan pada pemisahan molekular dari sel atau organel subselular. Pemisahan tersebut berdasarkan konsep  bahwa partikel yang tersuspensi di sebuah wadah akan mengendap (bersedimentasi) ke dasar wadah karena adanya gaya gravitasi.  Sehingga laju pengendapan suatu partikel yang tersuspensi tersebut dapat diatur dengan meningkatkan atau menurunkan pengaruh gravitasional terhadap partikel. Pengaturan laju pengendapan tersebut dapat dilakukan dengan cara menempatkan wadah yang berisi suspensi partikel kemesin sentrifugasi tepatnya pada bagian rotor yang kemudian akan berputar dengan kecepatan tertentu. Hal tersebut tergantung pada ukuran dan bobot jenis dari suspensi. Teknik ini dapat digunakan untuk mengisolasi dan mengkarakterisasi molekul biologi dan komponen selular. Hasil sentrifugasi terbagi menjadi dua, yaitu supernatan dan pelet. Supernatan adalah substansi hasil sentrifugasi yang memiliki bobot jenis yang lebih rendah. Posisi dari substansi ini berada pada lapisan atas dan warnanya lebih jernih. Sementara pelet adalah substansi hasil sentrifugasi yang memiliki bobot jenis yang lebih tinggi. Posisisnya berada pada bagian bawah (berupa endapan) dan warnanya lebih keruh. () Berdasarkan praktikum yang telah dilakukan sampel yang digunakan adalah klorofil. Data yang didapat dari praktikum ini ialah data rendemen dengan tiga kali pengulangan, rendemen pertama 0,3072 %b/b, rendemen kedua 0,2695 %b/b, dan rendemen yang ketiga 0,2522 %b/b. Rendemen adalah perbandingan antara minyak yang dihasilkan dengan bahan tumbuhan yang diolah. Besarnya rendemen yang dihasilkan antara jenis bahan yang satu berbeda dengan yang lainnya. (Anonim 2012) Bobot  suspensi kloroplas adalah berturut-turut sebagai berikut (1)18,80 ; (2)19,22 ; dan (3) 19,07.

Sentrifus digunakan dengan syarat dan ketentuan sebagai berikut yaitu pertama, bobot tabung yang digunakan harus seimbang agar gaya sentrifugal pada sentrifus menjadi seimbang. Keseimbangan tersebut juga mempengaruhi kecepatan rotor. Jika tidak seimbang maka dapat menyebabkan suspensi menjadi rusak bahkan terlempar ke luar bila sentrifus tidak terkunci rapat karena timbulnya presisi. (Robinson 1975) Kedua, Sebelum dijalankan sentrifus harus dalam keadaan vakum supaya tidak ada lagi gesekan dengan udara dan suhu tidak naik ketika rotor sedang berputar. Kemudian yang ketiga, homogenisasi dan fraksinasi dilakukan pada suhu 40C agar meminimalisir degradasi enzim-enzim terhadap komponen sel. (Miller 2000) Sentrifus yang digunakan pada percobaan ini adalah sentrifus berkecepatan tinggi yang sering digunakan dalam laboratorium biokimia. (Hendra 1989)

Instrumen pHmeter dapat digunakan untuk menentukan pH atau tingkat keasaman dari suatu sistem larutan.(Beran, 1996) Sifat asam atau basa suatu larutan dapat ditentukan dari jumlah ion hidrogen yang terkandung di dalam larutan tersebut. Sifat keasaman dari suatu larutan dapat  ditentukan dengan dua cara yaitu yang pertama, menggunakan kertas lakmus sebagai indicator asam atau basa dan yang kedua, menggunakan instrumen pH meter yang memiliki akurasi cukup tinggi. Pada percobaan kali ini, kita menentukan sifat keasaman suatu larutan dengan menggunakn pH meter. Larutan yang digunakan adalah larutan campuran dari fosfat (bersifat basa) dan asam sitrat (bersifat asam).  pH meter yang baik haruslah dirawat dengan baik pula agar nilai akurasi dan presisinya dapat terjaga. Berdasarkan hal tersebut praktikan haruslah mengkalibrasi instrument pHmeter tersebut sebelum digunakan untuk mengukur nilai pH suatu larutan. Prinsip kerja pada pHmeter ini menggunakan arus listrik yang tercatat pada sensor pH akibat adanya suasana ionic pada larutan. Keseimbangan sensor pH pada pHmeter harus dijaga dengan cara mengkalibrasinya. Beberapa hal yang harus diperhatikan dalam penggunaan pH buffer standar ini adalah menjaga pH meter dalam keadaan segar. Sensor pHmeter selalu dicuci untuk menjaga akurasi alat serta mencegah kontaminasi pada pH buffer. Selain itu, untuk lebih menjaga keawetan sensor, maka perlakuan sensor apabila tidak dipakai harus direndam/tercelup dalam aquades. Dan yang terakhir ialah temperature pHmeter harus selalu dijaga. Sebab, Kenaikan satu derajat temperatur menyebabkan perubahan nilai pH berkisar antara 0,01 sampai 0,02.

 

Kalibrasi pHmeter dapat dilakukan pada larutan standar dengan pH 4, pH 7, atau pH 10. Kalibrasi dapat dilakukan dengan tiga metode yang dapat dipilih salah satu. Ketiga metode tersebut adalah (1) metode satu titik pada sekitar pH yang akan diukur, yakni kalibrasi dengan buffer standar pH 4,01 untuk sistem asam, buffer standar pH 7,00 untuk sistem netral, dan buffer standar pH 10,01 untuk sistem basa. (2) metode dua titik (diutamakan) jika sistem bersifat asam, maka digunakan 2 buffer standar berupa pH 4,01 dan 7,00 Apabila sistem bersifat basa, digunakan 2 buffer standar berupa pH 7,00 dan 10,01 (3) metode multi titik yang dilakukan dengan menggunakan 3 buffer standar. Akurasi dari nilai pH untuk setiap buffer ditentukan sebagai fungsi temperatur.

Pada praktikum kali ini, praktikan menggunakan metode dua titik yaitu dengan menggunakan dua larutan yaitu larutan fosfat dan larutan asam sitrat.  Dengan metode ini, praktikan memperoleh data pH dalam bentuk pH terukur (menggunakan pHmeter) dan pH universal(menggunakan indicator universal). Dalam hal ini, pH terukur lebih akurat daripada pH universal. Hal itu disebabkanoleh  pH terukur yang menggunakan pHmeter memiliki sensor pH berupa arus listrik dalam larutan yang bersifat ionic daripada pH universal yang hanya mengandalkan warna pada trayek pH universal. pH terukur oleh pH meter berturut-turut untuk lima kali ulangan ialah 4,43 ; 4,31 ; 5,58 ; 7,31 ; dan 4,55 sedangkan pH universal 4 ; 4 ; 6 ; 7 ; dan 4.  Data yang didapat ada yang tidak normal yaitu pada ulangan keempat pH terukur 7,31 dan pH universal sebesar 7. Hal itu disebabkan karena adanya kesalah saat mencampurkan asam sitrat seharusnya 32,5 mL namun dimasukkan 17,5 mL dan fosfat yang seharusnya 17,5 mL dimasukkan 32,5 sehingga membuat pH yang diukur berbeda dengan pH yang seharusnya pada rencana kerja.

Simpulan

Jadi, berdasarkan praktikum yang telah dilakukan dapat disimpulkan bahwa sentrifus digunakan untuk mengendapkan suspense kloroplas agar didapatkan supernatan yang terpisah dari pelet. Sentrifus dengan rotor yang berkecepatan tinggi akibat adanya gaya gravitasi dapat mengendapkan suspensi kloroplas dengan rendemen yaitu rendemen pertama 0,3072 %b/b, rendemen kedua 0,2695 %b/b, dan rendemen yang ketiga 0,2522 %b/b. selain menggunakan sentrifus, praktikan juga menggunakan pHmeter dengan mengkalibrasinya menggunakan metode dua titik (menggunakan larutan asam sitrat dan fosfat) untuk membuat larutan buffer yang pH nya mendekati 4. pH dapat diukur dengan pHmeter yang lebih akurat daripada pH universal dengan pH yang terukur berturut-turut untuk 5 kali pengulangan yaitu 4,43 ; 4,31 ; 5,58 ; 7,31 ; dan 4,55 serta pH universalnya berturut-turut untuk 5 kali pengulangan yaitu 4 ; 4 ; 6 ; 7 ; dan 4.

 

 

Daftar Pustaka

Anonim. [terhubung berkala]

http://repository.usu.ac.id/bitstream/123456789/16345/4/Chapter%20II.pdf ( 2 maret 2012)

Artika IM, Safithri M. 2010. Diktat Kuliah Struktur dan Fungsi Subseluler.

Bogor:Departemen Biokimia.

Beran, J.A, 1996, Chemistry in The Laboratory, John Willey & Sons.

Bernasconi G. 1995. Teknologi Kimia I. Jakarta: Pradya Paramita.

Hendra Adijuwana. 1989. Teknik pemisahan Dalam Analisis Biologis. Bogor: IPB Press.

Miller J.N. 2000. Statistics and Chemometrics for Analytical Chemistry, 4th ed. Harlow:

Prentice. Hall.

Robinson J.R. 1975. Fundamental Of Acid-Base Regulation, 5th edition. Oxford: Blackwell

Scientific Publication.

Sastrohamidjojo, H, 1991, Spektroskopi, Liberty, Yogyakarta.

Tahir, Iqbal. 2008. Arti Penting Kalibrasi pada Proses Pengukuran Analitik : Aplikasi pada

Penggunaan pHmeter dan Spektrofotometer UV-Vis. [terhubung berkala] http://iqmal.staff.ugm.ac.id/wp-content/iqmal-2008-kalibrasi.pdf   ( 2 maret 2012)

 

 

 

2 Komentar »

g84100036_deva krisna kadarani

Tinggalkan komentar »

dampak kebiasaan buruk

dampak menahan kencing biasanya akan membuat kerusakan ginjal yang berkepanjangan. jadi jangan dibiasakan menahan kencing karena saluran kemih kita terlalu pendek untuk menahan air seni kita. hal itu lah yang membuat kerusakan ginjal. be healthy yah, take care to your body🙂

Tinggalkan komentar »